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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
>1. マウスからのCRC PDXの解剖
CRC PDXの解剖のための実験的手順は、図1B(ステップ2)に概説されています。
- 腫瘍が皮下で ~1 cm3 の大きさまで成長するのを待ちますが、これには通常約 1 〜 3 か月かかります。
- 小動物吸入麻酔装置を用いてマウスにイソフルラン吸入麻酔を施し、70%エタノールで皮膚を消毒します。
- マウスを実験台上で腹臥位に置きます。皮膚を切開し、腫瘍を露出させ、滅菌ハサミを使用して腫瘍から皮膚を慎重に剥がします。腫瘍を切除した後、10 cmのシャーレに置き、腫瘍から肉眼的な壊死領域を取り除き、5 mLのPBS.
で2回すすぎます。
手記：壊死性領域は、多くの場合、周囲領域よりも白く、柔らかく、砕けやすいです。
- 腫瘍を氷上に配置し、1)CRCオルガノイド培養、2)二次マウスへの移植、3)組織学的検査、4)腫瘍断片の凍結と保存など、さまざまな用途で少なくとも4つの部分に均等に分割します。
- CRCオルガノイドを作製するには、固形腫瘍組織を1 mLの滅菌PBSを含む6 cmのシャーレに置きます。処理までティッシュを氷の上に置いておきます。
- ヒトCRCのPDXモデルを確立するには、新しいCRC PDXをセカンダリマウスに移植します。滅菌済みのカミソリの刃を使用して腫瘍組織を小片(5 x 5 x 5 mm3サイズ)に切断し、これらの組織片を50 μLの人工細胞外マトリックスに静かに浸します。次に、これらの断片をNOGマウスの左右の皮下ポケットの下部に移植します。
- 麻酔をかけたマウスを実験台に腹臥位に置きます。レシピエントマウスの左右の脇腹の下部に小さな切開を行い、滅菌ハサミを使用して組織移植用の皮下ポケットを生成します。腹膜に穴を開けないように注意してください。この手順では、出血はほとんどないはずです。
- 上記で調製した腫瘍片を50μLの人工細胞外マトリックスに静かに浸し、次に左右の皮下ポケットの下部に埋め込む。
- 外科的処置を受けているマウスの創傷クリップで切開部を縫合します。移植された腫瘍組織が皮膚の下の切開部からある程度離れた場所にあることを確認してください.
手記：外科的処置を最小限に抑えることに従って、この研究では術後の痛みと感染症の治療は行われませんでした。
- マウスを温かいパッドに置き、十分な意識が回復するまで胸骨の横臥位を維持します。完全に回復し、4本の足すべてで座れるようになったら、マウスを自宅のケージに戻すことができます。捕食を防ぐために、同じケージ内で手術を受けていない動物との繁殖を許可しないでください。
- 組織学的解析では、サンプルを15 mLのコニカルチューブに封入した10%中性緩衝ホルマリン5 mLに室温で2日間固定します。
- 凍結保存のために、腫瘍組織を小片(5 x 5 x 5 mm3サイズ)に切断し、サンプルを1〜1.5 mLの凍結チューブに入った500 μLの細胞凍結溶液に静かに浸します。次に、チューブを-80°Cの冷凍庫に移します。
2. 大腸がんオルガノイド培養のための細胞懸濁液へのPDXの抽出
CRC PDXの解離の実験手順は、図1B(ステップ3)に概説されています。
- 上記(ステップ1.4.1)調製した腫瘍片を10cmのシャーレに置きます。
- 滅菌済みのカミソリの刃を使用してフラグメントをミンチにし、8 mLの10%ウシ胎児血清(FCS)-Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)と80 μLのコラゲナーゼ酵素ストックを含む15 mLの円錐形チューブに移します(材料の表を参照)。
- チューブをしっかりと閉じ、漏れを防ぐためにキャップをパラフィルムで包みます。ミンチした腫瘍断片を細胞懸濁液に解離するには、37°Cで2時間穏やかに撹拌します。チューブ内にはまだ未消化組織の断片が多数残っていることに注意してください。
- チューブを300 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去します。10 mLの10% FCS-DMEMを使用して細胞ペレットを分離し、細胞懸濁液を調製します。
- 未消化の組織破片を除去するには、50 mLのコニカルチューブにセットした40 μmのセルストレーナーを使用して、細胞懸濁液を2回ろ過します。次に、フロースルーを300 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を取り除き、ペレットを氷上に保ちます。
3. 人工細胞外マトリックス上で培養したCRCオルガノイドの作製
結腸PDXのCRCオルガノイド培養の実験手順を図1B(ステップ4)に示します。
- PDX由来のCRCオルガノイドに適した培地(Table of Materialsの「CRCオルガノイド培養培地」を参照)を、ヒト結腸オルガノイドについて前述した培地を用いて樹立する。
- 1ウェルあたり150 μLの人工細胞外マトリックス(材料の表を参照)を氷上の12ウェルプレートにアプスし、37°C、5%CO2インキュベーターで30〜60分間インキュベートしてゲルを固化させます。
- ステップ2.5の細胞ペレットを5% FCSを含むCRCオルガノイド培地(ステップ3.1)で懸濁し、3 x 105細胞/mLに調整します。次に、ステップ3.2で調製した人工細胞外マトリックスコーティングプレートに培地1 mLを播種します。5% CO2 で 37 °C で一晩インキュベートします。細胞懸濁液中の単一細胞および多細胞クラスター(接着細胞のグループ)を含む腫瘍細胞の数をカウントするために、血球計算盤を使用します.
注:この研究では、コラゲナーゼの残留酵素活性を消光するために5%FCSが使用されます。
- 人工細胞外マトリックスコーティングプレートから剥離した浮遊細胞を含む培地を翌日、1.5 mLの遠心チューブに慎重に集め、1,400 x gで5分間遠心分離します。次に、上清を取り除き、ペレットを氷上の人工細胞外マトリックス70μlに再懸濁します。
- CRC細胞の生存率を高めるには、人工細胞外マトリックスコーティングプレートに付着した腫瘍オルガノイド細胞に腫瘍細胞を含む人工細胞外マトリックスを重ね合わせ、37°C、5%CO2インキュベーターで30分間インキュベートし、人工細胞外マトリックスコーティングを固めます。次に、1% FCSを含む1 mLのCRCオルガノイド細胞培養培地と、5% CO2 下で 37 °C でインキュベー
トします。
- 培地は隔日交換してください。CRCオルガノイドが培地を満たすと、培地を毎日交換する必要が生じる場合があります。
>4. GFPレンチウイルス粒子の生成と濃縮
GFPレンチウイルス粒子の生成と濃縮の実験手順を図1C(ステップ5)に示します。
- 10% FCSを含むロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640培地でHEK293T細胞を培養し、次のトランスフェクション手順のために6つの10 cmディッシュ(ディッシュあたり2 x 106細胞)を調製します。
- ディッシュあたりのトランスフェクションには、DMEM中のトランスフェクション試薬20 μLを含む混合物500 μLを、PRRL-GFPベクター(5 μg)12およびpCMV-VSV-G(1 μg)およびpCMV-dR8.2 dvpr(5 μg)などの2つのレンチウイルスパッケージングプラスミドとともに、滅菌済みの1.5 mLマイクロチューブに調製します。室温で20分間保持した後、10cmの皿に重ねて18時間インキュベー
トします。
- 培地を取り出し、新鮮な10% FCS-RPMI 1640培地を5 mL各皿に加え、24時間放置します。
- 各ディッシュから馴染ませた培地を50 mLの遠心チューブに集め、合計30 mLの培地を4°Cで一晩保存します。新鮮なRPMI 1640を5mlずつ各皿に加え、24時間放置します。
- 各ディッシュからコンディショニングされた培地を50 mLの遠心分離チューブに集め、合計30 mLの培地を氷上に保ちます。次に、セルを破棄します。
- 0.45 μmフィルターで培地60 mL(ステップ4.4〜4.5)をろ過して細胞を除去し、この量を12本の5 mLポリプロピレン遠心チューブに分割して超遠心分離します。
- ウイルスを濃縮するには、スイングバケットローター(材料表を参照)を使用して、85,327 x g、4°C、1.5時間遠心
分離します。
- すぐにメディアを取り出します。濃縮ウイルスペレットを分離するには、250 μLの栄養ハム混合物F-12(F12)/FCSを含まないDMEM培地を12本のチューブのそれぞれに入れ、4°Cで一晩維持します。ウイルスペレットは見えないことが多いことに注意してください。
- 培地を静かにピペットで動かして、濃縮された5x GFPレンチウイルスストックを合計3 mL(おそらくGFPレンチウイルス粒子を含む)1mLあたり108形質導入単位(TU / mL)で回収します。次に、12本の1.5 mLマイクロチューブ(チューブあたり250 μLを含む)を-80°Cの滅菌条件下で最長1年間保存します。元の溶液の小さなアリコートを多数調製して、複数回の凍結融解サイクルを回避します。
>5. 人工細胞外マトリックス上で培養したGFPレンチウイルス粒子によるCRCオルガノイド細胞の標識
CRCオルガノイド細胞をGFPレンチウイルスで標識する実験手順を図1C(ステップ6)に示します。
- ステップ3.6で調製したCRCオルガノイドを7〜10日間干渉なく増殖させ、滅菌細胞スクレーパーを使用して機械的に収穫した後、1.5mLのマイクロチューブに移します
手記：培養中のCRCオルガノイドの増殖は、患者由来の元の腫瘍の性質によって異なります。CRCオルガノイドを60-70%のコンフルエンスに維持してから、1:2の分割比で新しい人工細胞外マトリックスでコーティングされた12ウェルプレートに移すことで、CRCオルガノイドの過成長を回避します。
- マイクロチューブを1,400 x gで3分間遠心分離し、培地を取り出し、500 μLのPBS中で細胞ペレットを穏やかにタッピングして分離します。
- マイクロチューブを1,400 x gで3分間遠心分離し、PBSを除去します。
- 付着したCRCオルガノイドを解離するには、チューブ内の細胞ペレットにタンパク質分解酵素とコラーゲン分解酵素の細胞剥離溶液500μLを加え、軽くたたいて混合します。その後、チューブを室温で10分間静置します。
- 1.5 mLマイクロチューブに500 μLの1% FCS-DMEMを数回加えて、細胞懸濁液を非常に穏やかにピペットで動かし、細胞を大まかに解離します。過酷なピペッティングによるCRCオルガノイドからの単一細胞の生成は、細胞生存率を著しく低下させます。したがって、細胞懸濁液中で細胞の塊を視覚的に検出可能なままにしておくために、1.5 mLのマイクロチューブで静かにピペッティングすることが不可欠です。
- 細胞懸濁液を1,400 x gで3分間遠心分離し、上清を除去します。
- 1.5 mL マイクロチューブに 5x GFP レンチウイルスストック (>10 8 TU/mL) 100 μL と CRC オルガノイド培養培地 400 μL を混合した細胞ペレットを、500 μL あたり 5 x 10 5 解離腫瘍細胞の濃度に調整するために優しくタッピングして分離します。腫瘍細胞の数をカウントするために血球計算盤を使用します。 上記のように、細胞懸濁液中の単一細胞および細胞群を含む(ステップ3.3)。
- ステップ3.2で説明したように、人工細胞外マトリックスでコーティングされた12ウェルプレートを調製します。次に、ステップ5.7で調製した細胞懸濁液500μlをプレートに置き、5% CO2の下で37°Cで18時間放置します。
- 浮遊細胞を人工細胞外マトリックスコーティングプレートから分離した培地を1.5 mLの遠心分離チューブに集めます。1,400 x gで遠心分離し、上清を取り除き、ペレットを70 μlの人工細胞外マトリックスに氷上に再懸濁します。
- CRC細胞の生存率を高めるには、ステップ3.5で説明したように、人工細胞外マトリックスでコーティングされた12ウェルプレートに付着した腫瘍オルガノイドに、腫瘍細胞を含む人工細胞外マトリックスを重ね合わせます。次に、プレートを37°C、5%CO2インキュベーターで30分間インキュベートして人工細胞外マトリックスコーティングを固化させ、1%FCSを含む1 mLのCRCオルガノイド培養培地で37°C、5%CO2未満で培養します。
- 感染後3日目に蛍光顕微鏡で細胞を観察し、高力価のレンチウイルス粒子を使用したことによるGFP陽性がほぼ100%であることを確認します(図2Aを参照)。
- CRCオルガノイドを7〜10日間培養して細胞増殖を拡大してから、レシピエントマウスに注入します。
>6. レシピエントマウスにおけるGFP標識CRCオルガノイドによる転移物の生成
GFP標識CRCオルガノイドを用いた転移生成の実験的手順は、図1C(ステップ7)に概説されています。
- GFP標識CRCオルガノイドを細胞懸濁液に解離するには、滅菌細胞スクレーパーを使用して機械的に回収し、上記のように1.5 mLマイクロチューブに移します(ステップ5.1)。
- マイクロチューブを1,400 x gで3分間遠心分離し、培地を取り出し、500 μLのPBS中で細胞ペレットを穏やかにタッピングして分離します。
- マイクロチューブを1,400 x gで3分間遠心分離し、PBSを除去します。
- チューブ内の細胞ペレットに細胞剥離液500μLを重ね、軽くたたいて混合します。次に、混合物を室温で10分間放置し、上記のように付着性CRCオルガノイドを酵素的に解離します(ステップ5.4)。
- 上記のように、1.5 mLマイクロチューブ内に500 μLの1% FCS-DMEMを数回加えて細胞懸濁液を非常に穏やかにピペットで動かし、細胞を大まかに解離させます(ステップ5.5)。過酷なピペッティングによるCRCオルガノイドからの単一細胞の生成は、細胞生存率を著しく低下させます。したがって、細胞懸濁液中で細胞の塊を視覚的に検出可能なままにして、1.5 mLのマイクロチューブで静かにピペッティングします。
- 細胞懸濁液を1,400 x gで3分間遠心分離し、上清を除去します。
- CRC PDXの自然転移マウスモデルを確立するには:
- マウスあたり50%人工細胞外マトリックスを含むPBSの50μLに5×10、5細胞を含む細胞懸濁液を調製します。使用前にサスペンションを氷上で維持してください。ステップ3.3に示すように、がん細胞をカウントするために血球計算盤を使用します。
- 小動物吸入麻酔器を用いてマウスにイソフルラン吸入麻酔を施し、70%エタノールで皮膚を消毒する。正常な呼吸速度と呼吸深度、および適切な麻酔のためのつま先のつま先つまみ反射がないことを確認します。目には獣医軟膏を塗る薬は、麻酔下での眼の乾燥を防ぐための選択肢です。
- NOGマウスを実験台上で仰臥位に置きます。滅菌ピンセットで直腸粘膜をつかみ、肛門からそっと引き出します。次に、ステップ6.7.1で調製した細胞懸濁液を直ちにシリンジ(針サイズ:22G)を使用してマウスの直腸粘膜下組織に注入します。通常、グループごとに4〜6匹のマウスを使用して結果を評価します。
