実験的転移マウスモデルの確立:GFP発現CRCオルガノイド細胞をPDXモデルに移植して微小転移を検出する

要約

出典:岡澤、Y. et al. 患者由来結腸腫瘍から培養したGFPレンチウイルス形質導入オルガノイドによる微小転移巣の高感度検出 (2018年)。

このビデオでは、GFPレンチウイルスで標識されたPDX由来のCRCオルガノイドが免疫不全マウスの脾臓に転移を生成するためのプロトコルについて説明しています。他の臓器にコロニーを形成するがんの微小転移は、蛍光顕微鏡を使用して検出し、GFP発現を評価できます。

プロトコル

動物が関わるすべての手続きは、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. レシピエントマウスにおけるGFP標識CRCオルガノイドによる転移物の生成

1. CRC PDXの実験的転移モデルを確立するには:
   1. マウスあたり50 μLのPBS中に4 x 10⁴細胞を含むCRCオルガノイド細胞懸濁液を調製します。使用前にサスペンションを氷上で維持してください。がん細胞をカウントするために血球計算盤を使用してください。(細胞懸濁液中の単一細胞および多細胞クラスターを含む腫瘍細胞の数を数えます)。
   2. 小動物吸入麻酔器を用いてマウスにイソフルラン吸入麻酔を施し、70%エタノールで皮膚を消毒する。正常な呼吸速度と呼吸深度、および適切な麻酔のためのつま先のつま先つまみ反射がないことを確認します。麻酔下での眼の乾燥を防ぐための、目にする獣医軟膏はオプションです。
   3. 麻酔をかけたNOGマウスを実験台上で腹臥位に置きます。左脇腹の下部に小さな切開を行い、次に腹膜を切開して、滅菌ハサミとピンセットを使用して脾臓を慎重に露出させます。滅菌ピンセットで脾臓に付着した脂肪組織をつかみ、細胞懸濁液(上記のように調製、ステップ1.1)の50μLを脾臓にゆっくりと注入します。細胞懸濁液が脾臓から外部に漏れることなく適切に注入されていることを確認してください。通常、グループごとに 4 匹のマウスを使用して結果を評価します。
2. 手術後、すべてのマウスを温かいパッドに置き、十分な意識が回復するまで胸骨横臥位を維持します。マウスが完全に回復し、4本の足すべてに座ることができるようになったら、マウスを自宅のケージに戻します。捕食を防ぐために、同じケージ内で手術を受けていない動物との繁殖を許可しないでください。
3. 縫合糸の漏れがないか確認し、翌日、外科的に治療されたグループでマウスが生きていることを確認します。マウスに病気の兆候がないか確認し、週に一度、すべてのマウスでノギスを使用して腫瘍のサイズを測定します。
4. マウスを観察して、注射後の自然転移(最大2.5か月)と実験的転移(1か月)を検出します。.
5. 指定された日に麻酔と子宮頸部脱臼によってマウスを犠牲にします。原発腫瘍と肝臓や肺などのさまざまな組織を解剖します。解剖した腫瘍と臓器を5 mLの氷冷PBSに入れ、10 cmのシャーレに置き、氷上に保存します。.
6. GFP陽性CRCオルガノイド細胞を検出するには、解剖した組織を実体蛍光顕微鏡で観察します。CCDカメラで画像を取得し、標準の画像処理ソフトウェアを使用して準備
します

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
NOD/Shi-scid IL2Rγ null(NOG)マウス	(一)中央実験動物研究所(神奈川県)	6週齢の雄マウスを無菌および特定の病原体を含まない条件下で繁殖
巻き付きクリップ 2×10mm	夏目製造業、日本	#C-21-S	使用前のオートクレーブ
ハミルトンシリンジ針サイズ:22ゲージ	東京サイエンス、日本	70%アルコールと滅菌PBSで消毒します。
50mlコニカルチューブ	住友ベークライト	MS-57500
マイクロチューブ	エッペンドルフ	#0030120086	使用前のオートクレーブ
血球計算盤	アーマ	#03-202-1
1%または5%FCSを含むCRCオルガノイド培地			DMEM/F-12 と GlutaMAX™ サプリメント (Gibco #10565018) に 1% または 5% FCS、100 U/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン、2 ng/ml hEGF、および 10 μM Y27632 (ROCK 阻害剤) を添加。4°Cで保存し、1ヶ月以内にご使用ください。
Zeiss Axioplan 2実体蛍光顕微鏡	ツァイス

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