分節性Adeno-Cre感染:遺伝子改変マウスモデルを用いた単離大腸がん作製技術

要約

出典:Betzler, A. M., et al. 散発性結腸直腸癌の遺伝子操作マウスモデル。J. Vis. Exp. (2017).

このビデオでは、分節的なアデノクレ感染による結腸直腸マウスモデルの生成について説明しています。感染した結腸セグメントは、粘膜のこのセグメント内で腫瘍形成を引き起こし、最終的に腺腫は浸潤性および転移性癌に進行します。このモデルは、がん生物学の研究や前臨床治療試験のための魅力的なプラットフォームです。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 外科的アデノクレ感染による局所腫瘍導入

1. 手術用動物の調製
   手記：事実上、任意の条件付き(「floxed」)突然変異は、ここで説明する方法を介して誘導することができる。Apc、Kras、またはTp53などの結腸直腸癌に関連する遺伝子の突然変異の使用が推奨されます。Cre再結合の効率は、切除するコンストラクトのサイズに依存します。大きなフロックス配列は、効率が悪くなります。すべての対立遺伝子の組換えは、PCRによって腫瘍で確認する必要があります。
   1. 結腸直腸腫瘍の発生には、CRCの基本モデルに次の条件付き対立遺伝子の十字架を使用します(括弧内はMGIデータベース番号):
      APC^tm2Rak (MGI: 3688435)
      Kras^tm4Tyj (MGI: 2429948)
      TP53^tm2Tyj (MGI: 3039263)
   2. 蛍光レポーター対立遺伝子が必要な場合(微小転移巣の検出など)は、次の対立遺伝子を使用します:
      GT(ROSA)26Sor^{tm6(CAG-ZsGreen1)Hze} (MGI:3809522)
      手記：上記のすべての系統は、NCI Mouse RepositoryまたはJackson Laboratoryから入手できます。アデノウイルス感染前に残りのすべての糞便を洗い流すことができるため、絶食は必要ありません。術前の絶食は周術期の死亡率の増加につながり、小さなげっ歯類にとって大きなストレスとなります。
   3. 全身麻酔には、セボフルランを3〜3.5 vol%で使用します。.つま先のつま先つまみ反射の喪失は、十分な麻酔がかかっていることを示しています。
   4. 最初の切開の前に、0.05 mg / kgのブプレノルフィンを皮下に注射します。.
   5. 角膜の乾燥を避けるために、麻酔をかけたマウスの目を眼科用軟膏で覆います。
   6. マウスを小さなテーブルの上に仰臥位に置きます。非外傷性の粘着テープを使用してマウスを拘束します。
   7. 電気シェーバー(脱毛クリームを代わりに使用できます)で腹部を剃り、アルコール綿棒またはヨウ素で消毒します。メーカーが推奨する連絡時間を使用してください。
   8. 手術野を滅菌ドレープで覆います.
      手記：周術期抗生物質の使用はオプションであり、施設のガイドラインの対象となります。
   9. すべての外科的処置には、滅菌済みの使い捨てまたは滅菌済みの器具を使用してください。
2. 正中線開腹術と結腸の露出
   1. ハサミ(メスも併用可能)を使用して、下腹部の皮膚に正中線切開(~15mm)を行います。
   2. 鉗子で腹壁の筋肉組織を拾い上げ、ハサミで慎重に切開し、腹腔を開きます。
   3. 遠位結腸を特定し、非外傷性鉗子でのみ触れます。繊細なクランプ(例:マイクロセレフィン血管クランプ)で結腸をクランプします 肛><門の近位約15mm。 手記：常に結腸の脆弱性に特別な注意を払ってください。穿孔は必然的に腹膜炎と敗血症を引き起こし、動物の安楽死を必要とします。
3. アデノクレウイルスによる分節性結腸感染
   1. 柔軟なテフロンチューブを経肛門的に挿入し、肛門縁から15mm前に配置されたクランプによって達成される内腔閉塞に達するまで慎重に進めます。無理な力を加えると、穿孔につながる可能性があるため、使用しないでください。
   2. 30Gカニューレでチューブをカニューレし、標準の1mLシリンジを接続し、正常な生理食塩水で結腸を洗い流して、残りの糞便を排出します。これには数mLの生理食塩水が必要な場合があります。
   3. 遠位結腸が空になったら、チューブを取り外して新しいテフロンチューブと交換し、上記のようにクランプの真遠位に再度配置します。
   4. 近位クランプから遠位 ~3 mm の 2 番目のクランプで結腸を閉塞します (つまり、挿入されたチューブの上、肛門縁から ~ 12 mm)、3 mm の孤立したセグメントが感染します。
      手記：セグメントの遠位閉塞には、Fogarty冠状動脈クリップがゴム引きされているため、クランプの枝の間に管腔内チューブがあるにもかかわらず、結腸がしっかりと閉塞することが証明されています。
   5. 2本目のシリンジ(標準1mL、30Gカニューレ付き)を使用して、50〜80μLの0.25%トリプシンEDTAをクランプされた結腸セグメントに慎重に注入し、10分間インキュベートします。カニューレとシリンジをテフロンチューブに取り付けたままにして、液体が逆流するのを防ぎます。
      手記：結腸は、粘膜障壁を破壊して陰窩幹細胞に到達するために膨らませる必要がありますが、クランプされたセグメントの穿孔を避けるために膨らませすぎないようにする必要があります。
   6. まず、遠位クランプを取り外し、次にトリプシンチューブを取り外します。
   7. 遠位結腸を ~ 500 μL の生理食塩水で洗い流し、残りのトリプシンを除去します。
   8. 新しいテフロンチューブを挿入し、遠位クランプを元の位置に戻し、50〜80 μLのアデノウイルス溶液(リン酸緩衝生理食塩水中の10¹¹プラーク形成単位(PFU)/mL)で結腸セグメントを膨らませ、30分間インキュベートします(図2A)
      手記：アデノクレとの接触は、条件付き変異マウスの任意の組織で腫瘍の発生につながる可能性があるため、ウイルス溶液をこぼさないでください。.
   9. clを取り外しますamp とチューブ。
4. 腹部の閉鎖と術後の回復
   1. 6-0の急速に吸収されるランニング縫合糸(例:.、ポリジオキサノン(PDS))。.
   2. 外科的創傷クリップで皮膚を閉じます。
   3. 麻酔から完全に回復するまで、マウスを38°Cに設定された加熱パッドに置きます。
   4. 手術の12時間後に0.05 mg / kgブプレノルフィンi.p.の別のボーラスを投与し、必要に応じて12時間ごとに追加のブプレノルフィンボーラスを投与します。.
   5. 腫瘍の成長による苦痛の兆候がないか、少なくとも1日1回マウスを監視します。

2. 大腸内視鏡検査

>注:使用される条件付き突然変異にもよりますが、アデノウイルス感染は2〜4週間以内に内視鏡的に見える腫瘍を引き起こします。したがって、アデノウイルス導入の2週間後に術後最初の大腸内視鏡検査を実施し、2週間ごとに繰り返します。マウスの大腸内視鏡検査には、市販のシステムが推奨されます。

1. 大腸内視鏡検査のための動物の調製
   手記：断食は必要ありません。残りの糞便は通常、遠位結腸で整形成されており、結腸内視鏡検査中に腫瘍を超えて押し出される可能性があるため、絶食を繰り返すストレスの多いプロセスが不要になります。
   1. 全身麻酔には、セボフルランを3〜3.5 vol%で使用します。.つま先のつま先つまみ反射の喪失は、十分な麻酔がかかっていることを示しています。
   2. 角膜の乾燥を避けるために、麻酔をかけたマウスの目を眼科用軟膏で覆います。
   3. マウスを小さなテーブルの上で仰臥位に拘束します。
2. 大腸 内視鏡 検査
   1. スコープ(直径1.9 mm、長さ10 cm)を肛門から腸管に挿入し、目視制御下で慎重に空気を注入して結腸を膨張させます。検査に必要な以上の空気を吸い込まないでください.
      手記：空気の送気には、大腸内視鏡検査システムの防曇エアポンプを使用できます。曇り止めエアポンプが利用できない場合は、非常に低圧設定の他のエアポンプを使用するか、繊細な減圧バルブで空気を加圧することができます。二酸化炭素(CO₂)は、小さなげっ歯類のアシドーシスを引き起こしやすいため、避ける必要があります。
   2. 遠位結腸の粘膜病変が特定されるまで、スコープを慎重に前方に押します(図1A-1D)。
   3. 後からの評価のために内視鏡画像を保存します。管腔内腫瘍に対する内視鏡スコアリングシステムは以前に説明されています。
   4. スコープを慎重に取り外し、麻酔から完全に回復するまで、マウスを38°Cに設定された加熱パッドに置きます。

結果

図 1.結腸直腸腫瘍の大腸内視鏡画像(括弧内は与えられた動物の条件付き対立遺伝子)。
A. 正常な遠位結腸 B. アデノクレ感染の2週間後の早期腺腫。このマウスのGFPレポーター対立遺伝子による緑色に注意してください。(Apc^tm2Rak, Kras^tm4Tyj, Gt(ROSA)26Sor^{tm6(CAG-ZsGreen1)Hze}). C. 遅発性腺腫 (Apc^tm2Rak, Kras^tm4Tyj). D. 結腸直腸腺癌 (大腸内視鏡検査画像が得られた後に病理学的に診断された;Apc^tm2Rak、Kr...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水	ライフテクノロジーズGmbH	14190169
トリプシン-EDTA(0.25%、フェノールレッド)	ライフテクノロジーズGmbH	25200072
生理食塩水0.9%(E154)	Serumwerk Bernburg AG	10013
アクアアドインジェクタビリア	B.ブラウンメルズンゲンAG	235144
Ad5CMV-Cre(アデノウイルス、c = 2E +11 PFU/mL)	遺伝子導入ベクターコアアイオワ大学
15 mL、50 mL遠心チューブ	グライナー・バイオワン社	188271/227270
エッペンドルフチューブ 1.5 mL/ 2 mL	ザルスタットAG & Co.	72,695,400
ペトリ皿PS 100/15 mm(滅菌、ヌクロン)	フィッシャーサイエンティフィックGmbH	10508921/ NUNC150350
1 mLシリンジ(デッドボリュームなし) - Injekt-F SOLO	ブラウン/neoLab	194291661
30G注射針	ベクトン・ディキンソン	304000
セボフルラン(Sevoflurane AbbVie)	AbbVie Germany GmbH & Co. KG (アッヴィ・ドイツ GmbH & Co. KG
医療用酸素	エア・リキード・メディカルGmbH
ブプレノルフィン(テムゲシック)	Indivior Eu Ltd.(英語)
Bepanthen - 眼科用軟膏	バイエルバイタルGmbH	10047757
テーブルトップ研究麻酔器 x/O2 フラッシュ セボフルラン気化器	パークランド・サイエンティフィック	V3000PS/PK
セルロース綿棒	ローマン&ラウシャー・ドイツ	13356
インスリンシリンジEMG 1 mL(30Gカニューレ付き)	B.ブラウンメルズンゲンAG	9161627S
ファインボアチューブ(内径0.28mm/径0.61mm)	スミスメディカルドイツ8	800/100/100
マイクロアドソン鉗子	ファインサイエンスツール	11018-12
アイリスシザー - タフカット	ファインサイエンスツール	14058-11
Olsen-Hegarニードルホルダー	ファインサイエンスツール	12002年12月
オートクリップキット	ファインサイエンスツール	12020年00月
PDS Z1012H 6/0 C1 (外科用縫合糸)	ジョンソン・エンド・ジョンソン・メディカルGmbH	Z1012Hの
湾曲したマイクロSerrefine血管クランプ	ファインサイエンスツール	18055-05
フォガティスプリングクリップ	エドワーズ	CDSAFE 6
ホットプレート062	ラボテクト	13854
Isis - ヘアシェーバー	Aesculap - ブラウン
コールドライトファウンテン キセノン 175	カールストルツ	20132101-1	カールストルツ コロビューシステム マインツ
光ファイバーライトケーブル	カールストルツ	69495NLの	カールストルツ コロビューシステム マインツ
TRICAM 3チップカメラヘッド	カールストルツ	20221030	カールストルツ コロビューシステム マインツ
TRICAM SLIIカメラコントロールユニット	カールストルツ	20223011-1	カールストルツ コロビューシステム マインツ
15インチフラットスクリーンモニターEndoVue	カールストルツ	9415NNの	カールストルツ コロビューシステム マインツ
ホプキンスストレートフォワード望遠鏡 直径1.9 mm、長さ10 cm、オートクレーブ可能な光ファイバー光伝送を内蔵	カールストルツ	64301のAA
保護および検査シース	カールストルツ	61029C

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