CRC細胞における微小管結合アッセイ:結腸直腸癌細胞における微小管結合タウタンパク質を調べる方法

要約

出典:Huda, M. N., et al. Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells. J. Vis. Exp. (2017).

このビデオでは、結腸直腸癌細胞の非結合性高リン酸化タウタンパク質画分から微小管結合タウタンパク質を分離するために使用される微小管結合アッセイについて説明しています。このアッセイは、タウタンパク質のリン酸化状態を変化させ、その微小管結合に影響を与える可能性のあるさまざまな化学物質の影響を判断するのに役立ちます。

プロトコル

1. 微小管結合アッセイ

1. 微小管結合アッセイでは、10% ウシ胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した Minimum Essential Media(MEM) を含む 100 mm の組織培養皿に ~1 x 10⁶ HCT 116 細胞を加えます。1日の培養後、細胞は60〜70%のコンフルエントに達します。
2. 4°Cで保存した10X PEMバッファーから1X PEMバッファーを調製し、20 μM(40 μL)パクリタキセルと1 mM(20 μL)GTPを添加します。-80°C冷凍庫から微小管(MT)ストックを、-20°C冷凍庫から大腸菌タウワーキングストックを取ります。
3. 表1に従ってサンプルを調製します。
4. 37°Cで30分間インキュベートし、超遠心分離を行い、25°Cで60分間、100,000 x gで
行いましょう。
5. 結合していないタウを含む上清120 μLを、洗浄して標識したチューブに移します。
6. 結合したタウを含むペレットに120 μL(上清と同容量)の5Xサンプルバッファーを加え、十分に混合します。溶液をラベル付きのきれいなチューブに移し、十分に混合します。
7. 市販のタンパク質アッセイキットを使用して、Bradfordアッセイによるタンパク質濃度を測定します.
   手記：サンプルを調製する際は、ペレットと上清の両方のサンプルを調製するための溶液の量(ステップ1.6)を使用します。
8. 同等のタンパク質濃度のサンプルを準備し、新たに調製したDTT(400 mM)を含む4x SDSゲルローディングバッファーを追加します。
   手記：この段階では、サンプルは-20°Cで保存できます。
9. サンプルを100°Cのヒートブロックで5分間インキュベートし、ボルテックスを使用してサンプルを混合します。室温で10~15分間冷却します。
10. 10%ポリアクリルアミドゲルを泳動するための電気泳動システムをSDS-PAGEで組み立てます。
    1. 1ウェルあたり10 μgのタンパク質(13 μLサンプル)を10%ポリアクリルアミドゲルにロードします。分子量ラダーをロードします。
    2. サンプルをロードした後、電気泳動システムの正極と負極を電源に接続して、一定の電圧を維持します。最初に、70 V で 20 分間開始し、タンパク質サンプルをスタッキングゲルから分離ゲルに移します。次に、電圧を125 Vに上げ、サンプルとタンパク質ラダーがゲルの端に達するまで、ゲルを約70〜120分間泳動します。
    3. 電気泳動が完了したら、湿式エレクトロブロッティングシステムを使用してゲルをPVDFメンブレンに移します。100 V で ~100 分間転送します。
    4. 分子量のはしごの側面に小さな切り込みを入れて、ブロットに印を付けます。透明なプラスチックシートと鋭利なカッターを使用して、ブロットをカットします。
11. メンブレンを4% BSAブロッキングバッファーで室温で90分間ブロッキングします。
12. ブロットを一次抗体溶液(抗タウ、1:5,000)で4°Cで一晩インキュベートします。ブロットをPBSTで4回、各7分間洗浄します。
13. 関連する二次抗体溶液(ヤギ抗マウスIgGを1:5,000)に調製し、ブロットを室温で90分間インキュベートします。PBSTで4回、各7分間洗浄します。
14. メーカーの推奨に従って、化学発光キットを使用してブロットを現像します。ブロットを透明なラップで覆います。化学発光イメージングシステムによる画像取得 化学発光
のためのソフトウェア。

表1:微小管結合アッセイ用のサンプル調製。

見本	名前	必要な微小管	必要な主なタンパク質	PEM-GTP-PTX
1	HCT 116-コントロール (6.21 μg/μl)	2 μl	9.66 μl (60 μg)	108.34μl
2	HCT 116-クルクミン 10 μM (4.81 μg/μl)	2 μl	16.63 μl (80 μg )	101.37μl
3	HCT 116-クルクミン 20 μM (3.28 μg/μl)	2 μl	30.49 μl (100 μg)	87.51μl
4	HCT 116-LiCl 25 mM (5.43 μg/μl)	2 μl	18.42 μl (100 μg)	99.58μl
5	大腸菌タウ	2 μl	1 μl タウ-352	117 μl
6	MTのみ	2 μl	バツ	118 μl
				各120μl

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HCT 116 セル	ATCCの	CCL-247
MEM(EBSS)	ハイクロン	01 SH30024月
100mmディッシュ	コーニング	430161
抗タウ13抗体	アブカム	AB19030
ジチオスレイトール(DTT)	ロシュ	10 708 984 001	保存温度 2–8 °C
マイクロリットル遠心分離機	ヘティヒ・ゼントリフューゲン	マイクロ200 R
パクリタキセル	シグマ・アルドリッチ	T1912	保存温度 2–8 °C
クルクミン	シグマ・アルドリッチ(フルカ)	78246	保存温度 2–8 °C
微小管(MT)	細胞骨格	MT001	4°Cで保存(乾燥させてください)
水酸化ナトリウム	シグマ	72068
塩化マグネシウム	シグマ・アルドリッチ	M2670
GTPの	シグマ・アルドリッチ	G8877	-20°Cで保存
DPBSの	ウェルジーン	LB 001-02
ソニックメモリー	フィッシャーサイエンティフィック	モデル500
超遠心分離機	ベックマン・コールター	オプティマL-100 XP
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ	A7906
分子イメージャー	バイオ・ラッド	ケミドックXRS+	4°Cで保存
プロテインアッセイ色素試薬	バイオ・ラッド	〒500-0006
α-チューブリン(11H10)ウサギmAb	細胞シグナル伝達	2125
GAPDH (14C10) ウサギ mAb	細胞シグナル伝達	2118
抗タウ(リン酸化S396)抗体	アブカム	ab109390 (英語
タウ-352 人間	シグマ	T型9950	-20°Cで保存
PVDFメンブレン	バイオ・ラッド	〒162-0177
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)	アフィメトリックス	75819
プロテインアッセイ	バイオ・ラッド	〒500-0006	4°Cで保存
ヤギ抗マウスIgG二次抗体	サーモフィッシャー	A-11005	暗所で4°Cで保存

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