全血サンプルからのCTC分離:マウス結腸直腸癌モデルからCTCを取得する方法

要約

出典:Kochall, S., et al. Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer. J. Vis. Exp. (2017).

このビデオでは、安楽死させた結腸直腸腫瘍マウスモデルの全血サンプルから循環腫瘍細胞を分離するための詳細なプロトコルについて説明しています。これらの単離されたCTCは、培養して目的のダウンストリーム分析に使用できます。

プロトコル

動物が関わるすべての手続きは、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 全血サンプルからの循環腫瘍細胞の単離

>注:麻酔をかけたマウスに経皮的心臓穿刺を行い、続いて安楽死させることで血液を採取します。理想的には、100 μLの抗凝固剤(エチレンジアミン四酢酸(EDTA)またはヘパリン)をあらかじめ充填したシリンジに1,000 μLの血液を吸い込みます。抗ヒトEpCAM(上皮細胞接着分子)抗体を用いてCTCを同定します。これは、ヒト上皮細胞株をマウスモデルで使用すると非常にうまく機能します。他のアプリケーションでは、異なる抗体が必要になる場合があります。

1. CTCエンリッチメント:
   1. 15 mLチューブに5 mL密度勾配培地をプレフィルし、血液を15 mLチューブに慎重に移します。
   2. 遠心分離(ブレーキなしの300 x gで30分)し、上部の上清を慎重に取り除きます。
   3. 残りを新しい15 mLチューブに注ぎ、遠心分離します(15分、ブレーキ付きで300 x g)。
   4. 単核細胞を含む間期を回収し(残りは破棄)、PBSで細胞を2回洗浄します。
   5. ペレットを200 μL PBS/1% EDTAに再懸濁し、4 μLのEpCAM抗体を添加します。暗闇の中で氷の上で20分間インキュベートします。
2. スクリーニングとピッキング
   1. 次のバッファー(以下、ピッキングバッファーと呼びます)を準備します:PBS + 10%子牛胎児血清(FCS)+ 1%ペニシリン/ストレプトマイシン(1%)+ 0.8%EDTA。
   2. PAPペンを使用して、6cmの滅菌ペトリ皿に~1cmの円を描き(液体が皿に分散するのを防ぎます)、この円に700μLのピッキングバッファーをピペットで移します。
   3. 円内の700 μLピッキングバッファーに50 μLの細胞懸濁液を加えます。顕微鏡で細胞の密度を確認します。サンプルが密度が高すぎる場合は、サンプルを異なる皿に分割します。
   4. 細胞が落ち着くのを待ちます (~5 分)。
   5. 細胞懸濁液の滴下をスクリーニングし、染色された(=EpCAM陽性)細胞を検出します。
   6. 細胞が見つかったら、マイクロマニピュレーターで細胞をピックし、目的のダウンストリーム分析に応じて50 μLのバッファー(RNA抽出バッファーや培養培地など)に入れます。
   7. 目的のダウンストリーム解析に応じて、EpCAM陰性細胞および/または培地をネガティブコントロールとして分離します。
   8. ダウンストリーム解析(細胞培養、PCRなど)を進めます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
密度勾配媒体 – Ficoll	幹細胞 - Lymphoprep	7801
Alexa Fluor 488 抗ヒト CD326 (EpCAM) 抗体クローン 9C4	バイオレジェンド	324210
Alexa Fluor 488 抗マウス CD326 (EpCAM) 抗体クローン G8.8	バイオレジェンド	118210
ペトリ皿、ø 60 x 15 mm、21 cm²、ベント	グライナーバイオワン	628102
蛍光細胞培養顕微鏡	ライカ
トランスファーマン4rマイクロマニピュレーター	エッペンドルフ
セルトラムエア	エッペンドルフ		マイクロマニピュレーターに接続された吸引ポンプ
DMZユニバーサルマイクロ電極プーラー	ダガンコーポレーション		シングルセル吸引用のマイクロキャピラリーの製造に必要
プリズムガラスキャピラリー	ダガンコーポレーション
PAPペン	アブカム
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水	ライフテクノロジーズGmbH	14190169	ピッキングバッファー
子牛胎児血清(FCS)	バイオクロムAG	S 0115	ピッキングバッファー
ペニシリン/ストレプトマイシン(ペンストレップ)	ライフテクノロジーズGmbH	15140122	ピッキングバッファー
EDTAの	ロス	8040.1	ピッキングバッファー
免疫組織化学
精製抗ヒトCD326(EpCAM)抗体クローン9C4	バイオレジェンド	324201	EpCAM免疫組織化学
HRPウサギ抗マウスIgG	アブカム	ab97046	EpCAM免疫組織化学