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1. 器官型の準備:
線維芽細胞含浸器官型ゲルの調製:
- 10% FCSおよび292 μg/ml L-グルタミンを添加したDMEMの器官型あたり5 x 105細胞を含む線維芽細胞懸濁液を調製します。
- 氷上の器官型ゲルを以下の比率で構成します。
- •ラットテールコラーゲン7巻:マトリゲルミックス(1:1)
- • フィルター付き10x DMEM1容量
- • FCS1容量
- • 5 x 105 個の線維芽細胞を含む線維芽細胞懸濁液 1 容量
9ゲル(1ゲルあたり1ml)の場合、10mlを準備し、泡を避けるために穏やかに混ぜます。
- 24ウェルプレートの各ウェルに1 mlを加え、加湿雰囲気で37°Cで1時間インキュベートしてゲルを硬化させます。1時間後、ゲルの上に1 mlのDMEM(10%FCS)/Glutを加え、インキュベーターに一晩戻します。
- 翌日、ゲルの上部から培地を吸引し、5 x 105 CRC上皮細胞を含む培地1 mlをプレート化します。
ゲルコーティングされたナイロンシートの調製:
- 1.5 cm x 1.5 cmの滅菌済みオートクレーブナイロンシートを事前に準備します。
- 滅菌鉗子を使用して、必要な数のナイロンシートを10cmの培養皿に入れます(通常、皿ごとに4枚のナイロンシートを収容できます)。
- 氷上でゲルを次の順序で作ります(ナイロンシートあたり合計容量250μlが必要です)。
- • ラットテールコラーゲン 7 巻
- • フィルター付き10x DMEM1容量
- • FCS1容量
- • DMEM 10% FCS/Glut 1 容量
- 溶液が黄色の場合は、溶液がピンク色に変わるまで、50 μlアリコートに0.1 M NaOHを添加して中和します。
- この溶液250μlを各ナイロンシートに加え、5% CO2の加湿雰囲気で37°Cで30分間インキュベートし、ゲルを固めます。
- PBS中の1%グルタルアルデヒド溶液をメイクアップします。ゲルが固まったら、各10 cm培養皿に10 mLを加え、4°Cで1時間インキュベートします。
- ナイロンシートをPBSで3回、DMEM(10%FCS)/Gluで1回洗浄し、DMEM/Gluで4°Cで一晩インキュベートします。
侵入のために器官型ゲルをスチールグリッド上に浮上させる:
- ステンレス鋼板を三脚状に折りたたんで、足場グリッドを事前に準備します。使用前にオートクレーブをかけてください。
- エタノールで滅菌した鉗子を使用して、6ウェルプレートの各ウェルにスチールグリッドを配置します。
- コラーゲン側を一番上にしてジェルコーティングしたナイロンシートを各グリッドに置きます。
- エタノールで滅菌したスパチュラを使用して、24ウェルプレートから隆起したナイロンシートに有機型ゲルを慎重に移します。
- DMEM 10% FCS/Glut に 10% FCS を添加したウェルを、ナイロンシートが培地と接触しているが水没していないまで満たします。培地が器官型ゲルに触れないようにしてください。
- 5% CO2の加湿雰囲気下で37°Cで14日間インキュベートし、2日ごとに培地を交換します。
2. 器官型固定
- ナイロンシートを含む器官型全体をウェルから取り出し、ラップフィルムの上に置きます。
- 清潔な使い捨てメスを使用して二等分器官型とナイロンシートを両半でホルムアルデヒドに固定し、室温で24時間固定します。
- 24時間後にホルムアルデヒドを70%エタノールに交換し、一晩放置してからパラフィンに包埋し、切片化し、染色します。
3. 侵襲性マージンのレーザーマイクロダイセクション
- 厚さ10μmまでの切片をメンブレンマウントスライドに取り付けます。
- キシレンを1分間塗布して切片を脱パラフィンし、次にキシレンを除去し、75%エタノールをさらに1分間固定します。
- エタノールを除去し、0.125% Cresyl Violet溶液で1分間染色します。
- クレシルバイオレットを取り除き、100%エタノールをさらに1分間塗布してから、100%エタノールですすいでください。スライドを30分間風乾させます。
- 選択したプラットフォーム(ライカASシステムなど)を使用してレーザーマイクロダイセクションを実施します。
- 顕微鏡解剖するステンド部分のあるスライドガラスを下向きにして顕微鏡ステージに置きます。
- 0.5 mLの微量遠心チューブをコレクションカセットにセットし、50 μlの細胞溶解バッファー(DNA、RNA、タンパク質溶解バッファーなど)をキャップに加え、マイクロダイセクションした組織を回収します。
- 直視下で、ジョイスティックを使用して目的の組織を特定します。ソフトウェアインターフェースを使用して、染色された有機切片に注釈を付け、腫瘍浸潤フロントでマイクロダイセングされる細胞を強調表示します。
- レーザーに発射を指示すると、強調表示された部分が切り取られ、マイクロ解剖された組織がマイクロ遠心チューブのキャップに推進されます。
- 十分な材料が収集されたら、収集カセットを取り出し、微量遠心チューブを閉じて静かに回転させ、溶解バッファーをチューブの底に引き込みます。
- マイクロダイセクションが完了するまで、サンプルを氷上に置きます。適切な方法でサンプルを処理し、目的の分析物を抽出します。