トラクションサイトメトリーアッセイ:がん細胞がECMに及ぼす牽引力を定量化する方法

Abstract

出典:Ali, M. Y., et al. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Cultturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J. Vis. Exp. (2015).

このビデオでは、牽引力顕微鏡アッセイについて説明しています。このアッセイは、蛍光ビーズが埋め込まれた軟質弾性ヒドロゲル上に存在する細胞外マトリックス上のヒト結腸がん細胞の細胞牽引力を決定します。結果として生じる蛍光ビーズの変位は、適切なソフトウェアを使用して測定されます。

Protocol

1. 牽引力顕微鏡アッセイ

1. 0.25% トリプシン-EDTA/10% SDS 溶液を 37 °C の水浴中で 10 分間温め、牽引実験を開始します。
2. 細胞培養インキュベーターから1つのゲル(PAゲルとガラスをECM分子、ヒトフィブロネクチン、50 μg/mlの濃度で官能基化)を一度に取り出し、蛍光倒立顕微鏡ステージ(倍率32倍)に置きます。
3. 視野内の 1 つのセルを検索します。ペトリ皿の蓋を取り外します。
4. 細胞の位相コントラスト画像を取得します(例:図1)。
5. イメージングモードを蛍光に切り替え、適切なフィルターを選択します。この間、顕微鏡のステージやサンプルを動かさないでください。
6. 細胞の牽引によって変位した蛍光ビーズの画像を撮ります(図2C)。
7. 1 mLのトリプシン/ SDS溶液をペトリ皿に加えて、細胞をゲルから分離します。この間、顕微鏡のステージやサンプルを動かさないでください。また、ゲルから完全に除去するために、細胞のコントロール画像を撮影します。
8. セルが除去された後のビーズの参照(ヌルフォース)画像を撮ります。
9. 他のすべてのゲルについて、手順1.2〜1.8を繰り返します。
10. 各ケースについて、手順 1.6 と 1.8 で取得した 2 つの画像から ImageJ を使用して画像スタックを作成します。イメージ スタックを生成するには、イメージを開いた後に ImageJ で Image → Stacks → Images to stacks という一連のコマンドを使用します。
11. ディスプレイスメントフィールドとトラクションを取得するには、公開されている方法に従ってImageJプラグインを使用します。これらのプラグインのコードと詳細なチュートリアルは、次のリンクから入手できます: https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
    1. 「Template Matching」プラグインを使用して、スタック内の画像を整列させます。手順 1.10 で生成したイメージスタックを開いた後、ImageJ で次のコマンドを使用します: 「Plugins → Template Matching → Align Slices in Stack」 → OK をクリックします。イメージスタックを保存します。その結果、イメージスタックを保存します。次の手順では、この新しいイメージスタックを使用します。
    2. PIV(粒子画像速度測定)プラグインを使用して変位場を取得します(図2D)。ステップ 1.11.1 で保存したイメージスタックを開いた後、次のコマンドのシーケンスを使用します: PIV → → 反復 PIV (基本) → OK → この PIV を受け入れて出力 → OK. PIV 出力を元のイメージスタックと同じディレクトリに保存します。 PIV 出力を元のイメージスタックと同じディレクトリに保存します。これを次の手順の入力として使用します。
    3. 最後に、FTTC(フーリエ変換トラクションサイトメトリー)プラグインを使用して、トラクションマップを取得します(図2E)。次の一連のコマンドを使用します: FTTC → プラグイン → 材料特性、つまり PA ゲルのヤング率とポアソン比を挿入 → OK → 手順 1.11.2 で保存した PIV 出力ファイルを選択します → OK FTTC の結果は、画像スタックおよび PIV 出力と同じディレクトリにあります。

Results

図 1.初代ヒト結腸細胞(がんと正常の両方)を、異なる硬さのゲルとポリスチレン皿で成功させました。位相コントラスト画像は、(A)腫瘍細胞と(B)正常細胞の異なる剛性基質上の典型的な形態を示しています。

図 2.(A) 浸潤性腺癌を確認するH&E染色。(B)フィブロネクチン染色により、ゲルがECM分子で均一にコーティングされていることが明らかになりました。(C)受託マーカーとしてゲル内に埋め込まれたナノスケールビ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBSの	ロンザ	17-516階
トリプシン	ワージントン	LS003736
アクリルアミド	シグマ・アルドリッチ	A4058 (英語)
N-メチレンビスアクリルアミド(ビス)	シグマ・アルドリッチ	M1533
ヒトフィブロネクチン	BDバイオサイエンス	354008
0.1 μmのフルロセントビーズ	ライフテクノロジー	F8801
0.25%トリプシン-EDTA	ライフテクノロジー	〒25200-056
12 mm2ガラスカバースリップ	コーニング	2865-12