細胞骨格および焦点接着組織化アッセイ:免疫蛍光法による細胞接着および基質への拡散の研究

要約

出典: Ali, M. Y et al., Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Cultturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J. Vis. Exp. (2015)

このビデオでは、ヒトの原発性結腸がん細胞の細胞骨格と焦点接着を研究し、基質の剛性に応じたその変化を理解する技術について説明しています。軟質および硬質基質上でのがん細胞の培養により、がんの予後に関するさまざまな下流の生物物理学的測定が可能になります。

プロトコル

1. 免疫蛍光顕微鏡アッセイ

1. 免疫染色する細胞を含む基質を層流フードに取り、培地を取り出します。
2. 基質をPBSですすぎ、細胞をPBS中の4%パラホルムアルデヒドで室温で20分間固定します。
3. 基板をPBSで3回(各回5分)洗浄します。したがって、基質を500 μLシグナルエンハンサーで30分間インキュベートし、PBSですすい
でください。
4. モノクローナル抗ビンキュリン抗体と細胞をPBSで1:250希釈し、室温で45分間インキュベートします。次に、基板をPBSで3回(各回5分)洗浄します。
5. サンプルを二次抗体Alexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgGとPBSで1:200希釈、室温で30分間インキュベー
トします。
6. F-アクチン構造を可視化するには、TRITCファロイジンコンジュゲートと細胞を50 μg/mlの濃度でRTで45分間インキュベートします。次に、基板をPBSで3回(各回5分)洗浄します。
7. 共焦点走査型レーザー顕微鏡を使用してサンプルを画像化します(図1A-1D)。

結果

図 1.ソフトゲルおよび硬質ポリスチレン基質上のF-アクチンおよびビンキュリンの免疫蛍光染色。軟質2 kPaゲル上の広がりの少ない(A1)腫瘍細胞または(A2)正常細胞にはアクチン繊維は存在しませんでした。ただし、点状ビンキュリン含有焦点接着は、軟質ゲル(B1-B2)上に存在します。逆に、初代細胞は、硬質ポリスチレン基質上に、よく広がる形態、明確に定義されたアクチンストレスファイバー(C1-C2)、および離散的な細長い焦点接着(D1-D2)を示します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬
PBSの	ロンザ	17-516階
パラホルムアルデヒド	電子顕微鏡科学	RT15710
シグナルエンハンサー	ライフテクノロジー	I36933
モノクローナル抗ビンキュリン抗体	シグマ・アルドリッチ	V9131
Alexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgG	ライフテクノロジー	A11001 (英語)
TRITCファロイジンコンジュゲート	シグマ・アルドリッチ	P1951
料
12 mm2ガラスカバースリップ	コーニング	2865-12

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