凍結皮膚組織ブロックの準備:マウス背側皮膚からの皮膚黒色腫サンプルを保存するためのプロトコル

要約

出典:Moon, H., et al. 変異メラノサイト幹細胞からのマウスメラノーマ開始の空間的および時間的制御。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、メラノーマを含むマウスの背側皮膚を分離するための詳細なプロトコルと、凍結皮膚組織ブロックを調製するための凍結埋め込みについて説明しています。クライオに埋め込まれた組織ブロックは、切片化して顕微鏡で調べて、黒色腫の進行を研究することができます。

プロトコル

動物が関わるすべての手続きは、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 組織処理

1. 皮膚の分離
   1. 開始前に、剖検器具、濾紙、ペーパータオルを入手してください。
   2. 承認されたプロトコルに従ってマウスを安楽死させ、進行する前に死亡を確認します。
   3. バリカンを使用して、背側の皮膚部分の毛を剃ります。糸くずの出ないティッシュでその部分を軽くブラッシングして、その部分をきれいにします。
   4. 尾の付け根のすぐ上に鋭利なハサミで小さな切開をします。
   5. 大きな鈍いハサミを切開部に挿入し、皮下結合組織を分離します。
   6. 組織の端に沿って鋭利なはさみで切ることにより、関心のある皮膚領域を慎重に分離します。
   7. 清潔なペーパータオルの上に皮膚組織を置き、鈍い鉗子を使用して皮膚を伸ばし、タオルに密着してぴんと張るようにします。このステップは、組織の形状を維持しながら組織を操作および処理できるように、組織に追加のサポートを提供するのに役立ちます。
      手記：鉗子は組織学的に見られる皮膚に損傷を与える可能性があるため、皮膚組織の外側の領域のみを取り扱うように注意してください。
2. 組織固定
   1. ろ紙を半分に折り、適切にラベルを付けます。折り目のすぐ隣にある折りたたまれた紙にペーパータオルを裏打ちして皮膚を置き、サンプルが滑らかで折りたたまれたりしわくちゃになっていないことを確認します。開いた側面をホチキス止めして濾紙を密封し、残りの紙を将来のサンプルに使用できるようにトリミングします
      手記：このステップは、固定中に皮膚がその形状を保持するために実行されます。
   2. 組織サンプルを10%中性緩衝ホルマリンに室温で3〜5時間、または4°Cで一晩完全に沈めます。
   3. 固定後、ホルマリンからサンプルを取り出し、脱イオン水で洗浄し(各5分×2回)、ティッシュブロックの作成に進みます。皮膚組織から残留物(つまり、残留紙)を慎重に取り除きます。
3. 凍結ティッシュブロックの作成(図1)
   1. 皮膚サンプルの端がギザギザにならないようにトリミングしてから、矢状に3つのカットを行います。これらのストリップの幅は、クライオモールドの高さ(5 mm)を超えてはなりません。次に、横方向にカットして、クライオモールドの幅(20 mm)より長くなく、埋め込むことができる皮膚の部分を作成します。背側の皮膚の残りの半分で繰り返すか、他の用途のために組織を保存します(または、固定する前に半分を保存します).
      手記：皮膚片を適切な向きに保つことが重要です。
   2. クライオモールド(25 x 20 x 5 mm³)を縦向きに向け、OCTの上に4〜5枚の皮膚を置きます。すべてのピースが所定の位置に配置されたら、2対の細い鉗子を使用して、皮膚の長い方の端をクライオモールドの底に持ってきます。これで、スキンが型のベースに対して垂直なOCTで立ち上がっているはずです。このステップでは、OCT内のエアポケットの形成を最小限に抑えるように注意してください(図1)。
   3. 型にOCTを2番目のリップまで充填し、ドライアイスの平らな面に置きます。鉗子を使用して、ブロックが凍結し始めるときに移動中にずれた可能性のある皮膚片を調整します。最下層が固化すると、組織の操作は不可能になります。
   4. 8〜10μmのスライドをカットして分析します。
4. ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織ブロックの作成
   1. ラベル付きのカセットに2枚の固定皮膚を入れ、エタノールの濃度を増やして脱水します(75%エタノールで30分間、85%で30分間、90%で30分間、95%で30分間、100%で2x 30分間、キシレンまたはキシレン代替品2x 30分)。パラフィンと58〜60°Cで、最初に30分間、次に一晩インキュベー
   トします。
   2. 流動パラフィンを入れた24 x 24 mm²のステンレス製ティッシュモールドに組織を埋め込み、-5°Cで固化します。組織の向きは、複数の毛包の縦方向の切片を視覚化できるように、凍結組織ブロックの向きと類似させる必要があります(図1)。
   3. パラフィンが固まったら、型を取り出し、分析のために5〜10μmのセクションにカットします。

結果

図1:皮膚組織の分離とクライオ埋め込み。安楽死後、マウスの背側の皮膚の関心領域を剃り、OCTを含むクライオモールドに皮膚を埋め込みます。マウスの点線は正中線を表します。通常、3つまたは4つの皮膚片は、正中線に沿った線分3〜4で分離できます。そのようなピースの1つは、長方形1/2/3/4で示されます。これらのスキンピースは、図に示すようにOCTに埋め込む必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ペットの毛のトリマー	ヴァール	09990-502
脱毛クリーム	ナイル	該当なし	ほとんどのドラッグストアで取り扱い
綿棒	諸
紫外線電球	UVPの	〒95-0042-08	モデルXX-15MミッドレンジUVランプ
200プルーフエタノール	諸		純粋なエタノール
Histoplast PE	フィッシャーサイエンティフィック	22900700	パラフィンペレット
中性緩衝ホルマリン、10%	シグマ	HT501128-4L
O.C.T.コンパウンド	熱	23730571
ティッシュカセット	さくら	89199-430	FFPE加工用
クライオモールド	さくら	4557	25 x 20
FFPE金型	ライカ	3803082	24 mm x 24 mm
イソフルラン	諸		獣医グレード
麻酔吸入システム	諸		獣医グレード
細いハサミ	FSTの	14085から09	ストレート、シャープ/シャープ
細いハサミ	FSTの	14558から09	ストレート、シャープ/シャープ
鉗子	FSTの	11252から00	デュモン #5
鉗子	FSTの	11018-12	マイクロアドソン
Tyr-CreER;LSL-BrafV600E;Pten f/f	ジャクソン研究所	13590
LSL-tdトマト	ジャクソン研究所	7914	アイ14

名 ミリメートル 名