患者由来異種移植片モデリング:黒色腫マウスモデルを生成する技術

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マウス移植のための腫瘍組織処理

1. 外科的切除または外科的生検組織処理
   1. 組織を滅菌ペトリ皿に移し、腫瘍組織を周囲の正常組織からできるだけ分離します。
   2. 壊死組織(通常、腫瘍の中央に位置する淡い白っぽい組織として識別される)を残りの腫瘍からできるだけ取り除きます。
   3. メスを使用して、最初の腫瘍チャンクをほぼ等しい部分(~3 mm x 3 mm)に細分化し、外科的マウス移植を行います(図1)。
   4. 必要に応じて、十分な腫瘍組織が利用可能である場合は、ダウンストリームアッセイ(RNAシーケンシング[RNASeq]、全エクソームシーケンシング[WES]など)のために組織をスナップフリーズします。
   5. 2つのメスブレードを備えたクロスブレード技術を使用して腫瘍組織をミンチすることにより、腫瘍スラリーを作成します。腫瘍の塊をできるだけ細かく刻んでスラリーを形成し、マウスの外科的移植の準備が整います。
   6. あるいは、腫瘍組織が機械的解離には硬すぎる場合は、消化解離手順を使用して、ゲル状のスラリーと移植および/または注射用の単一細胞懸濁液を形成します。
      1. 腫瘍の塊をできるだけ細かく刻んでスラリーを形成します。
      2. スラリーを50 mLチューブに入れ、冷たくしたハンク平衡塩溶液(HBSS)^-/-(Ca⁺⁺およびMg⁺⁺なし)を入れ、次いで、ペレットを220 x gで4分間、4°Cで遠心分離する。
      3. 腫瘍組織1gあたり10 mLの温めた新鮮な消化媒体(200 U / mLコラゲナーゼIV + 5 mM CaCl₂ + ^HBSS-/-中の50 U / mL DNase)にスラリーを再懸濁します。.
      4. チューブを37°Cのウォーターバスに20分間置き、使い捨てピペットで5分ごとに激しく混合します。
      5. 最大 50 mL の HBSS^-/- で洗浄し、その後、220 x g で 4 分間、4 °C で遠心分離します。
      6. 腫瘍組織1 gあたり5 mLの予熱済みTEG(0.025%トリプシン + 40 μg/mLエチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸[EGTA] + 10 μg/mLポリビニルアルコール[PVA])を加え、穏やかに再懸濁/振盪し、チューブを37°Cで2分間混合せずに置きます。
      7. 等量の冷染色培地(1% ウシ血清アルブミン[BSA]+10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸[HEPES]+L15培地中の1xペニシリン-ストレプトマイシン)を少なくとも1つ加えてトリプシンをクエンチし、220 x gで4°C、4分間遠心分離します。
      8. 腫瘍組織1gあたり10 mLの染色培地にサンプルを再懸濁し、40 μmのセルストレーナーでろ過して、マウス注射用のシングルセル懸濁液を得ます(図1)。
      9. セルストレーナーの上部に残ったスラリーは、マウスの外科用移植のためにも回収することができます。
2. マウスへの腫瘍移植と注射
   1. 外科的切除または外科的生検組織の移植
      手記：オートクレーブ滅菌または滅菌済みの使い捨て器具を使用して、すべての手術器具が滅菌されていることを確認してください。
      1. NSG 6-8週の雄または雌マウスの腰から毛を剃り、約1.5 cm x 3 cmの毛のない領域を残します。イソフルランを用いてマウスに麻酔をかけ、反応性のテストとして足を優しく絞って確認します。乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
      2. 麻酔器のノーズコーンにあるヒートパッドに個々のマウスを置き、剃った部分をクロルヘキシジンでこすります。次に、70%エタノールを注ぎ、蒸発させます。
      3. 外科的移植のために、ペトリ皿でチャンクを準備するか、腫瘍スラリーを個々のマウンドに分割します(つまり、3匹のマウスに移植する場合は3つの等しいマウンドに
      )。
      4. メスの刃を使用して、マウスの背面の中央に約5 mmの長さの切開を行い、1対の鉗子を取り、オペレーターの反対側の切開側の皮膚を持ち上げます。
      5. ハサミをもう一方の手に取り、小さなハサミで筋膜を優しく切って筋肉層から皮膚を分離し、腫瘍組織のための「ポケット」を作成します。
      6. メスの刃で腫瘍の塊または腫瘍スラリー組織の個々の山を1つ拾い上げ、作成したポケットに組織をそっと入れます。
      7. 100 μLの人工細胞外マトリックスをポケット内の腫瘍組織マウンドに投与します。
      8. 2対の鉗子を使用して、創傷の端が互いに接近するように両端の切開部を引き上げ、1つまたは2つの創傷クリップを適用して創傷を閉じます。
      9. 手術後のマウスに鎮痛剤として1〜5 mg / kgメロキシカムを皮下注射します。.
      10. マウスをノーズコーンから取り出し、元のケージに戻します。目を覚ましながらマウスを観察します。完全に回復するまでケージに戻らないでください。
      11. 約7日後に創傷クリップを取り外します。7日経っても治癒しない場合は、傷口クリップをさらに1〜2日間そのままにしておきます
          手記：外科的切除または外科的生検組織処理からの単一細胞懸濁液を使用する場合、マウス注射用の人工細胞外マトリックス(1:1の比率)と混合します。
   2. FNAまたはコア生検組織の注入
      1. NSG マウスをスチール製のグリッドラックに置き、マウスの尾をしっかりと持ち、マウスをゆっくりと引き戻します。前足でグリッドをしっかりとつかみます。または、利き手ではない手でマウスを拘束し、側面の領域が見えるようにします。
      2. アルコール調製綿棒で脇腹の皮膚を消毒します。シリンジの内容物をマウスの皮膚の下にゆっくりと着実に注入します。
      3. 針を引き出し、マウスをケージに戻します。
3. 腫瘍の成長を監視する
   1. マウスを週に1回モニターして、触知可能な腫瘍がないか確認します。
   2. 腫瘍が測定可能なサイズ(約50 mm³)になったら、キャリパーを使用して腫瘍の寸法を記録します。次の式を使用して腫瘍の体積を計算します:(幅x幅x長さ)/ 2。
   3. 腫瘍の体積が約1.5 cm³(約4〜10週間)に達したら、腫瘍を採取します。この腫瘍は現在、マウスパッセージ1(MP1)と呼ばれています。

図1:代替の移植方法。(A)腫瘍は、チャンク、スラリー懸濁液、または単一細胞懸濁液のいずれかに処理できます。(B)3つの方法はすべて、生体内での腫瘍の増殖を可能にする。ここに示されているのは、腫瘍を皮下に移植し、移植後12日で画像化したマウスです。(C)示されているのは、3つの移植方法のいずれかを注入したマウスの腫瘍成長曲線である。腕あたりN = 5;エラーバーは標準エラーです。