ハンギングドロップ法:3次元黒色腫スフェロイドを生成する技術

要約

出典:Müller, I. et al., 3D器官型黒色腫スフェロイド皮膚モデル。J. Vis. Exp.(2018年)

この動画では、メラノーマ細胞を用いたハンギングドロップ法により3次元スフェロイドを生成する技術について説明しています。生成されたin vitro 3次元(3D)器官型黒色腫スフェロイドモデルは、悪性黒色腫のin vivo構造を描写でき、腫瘍内相互作用に関する洞察を与える可能性があります。

プロトコル

1. ハンギングドロップ法による3次元黒色腫スフェロイドの生成

1. メラノーマ細胞(例えば、451-LU、または任意の目的のメラノーマ細胞株)を、10%FCSを含有するRPMIを使用して、一般的なプロトコルに従って培養する。
   1. 同程度のサイズと品質のメラノーマスフェロイドを作製するには、PBSでメラノーマ細胞を洗浄し、PBS中の1x Trypsin-EDTAを5 mLのT175細胞培養フラスコで細胞に加え、室温(RT)で3〜5分間インキュベートします。5 mL RPMI / 10%FCSを追加してトリプシンを中和します。.細胞を200 x gで5分間遠心分離して回収します。細胞ペレットをRPMI/FCSに再懸濁し、血球計算盤でカウントして決定した最終濃度10,000細胞/mLにします。
2. 電子マルチピペットを使用して、無菌非粘着性細胞培養皿(Ø 10 cm)の蓋の内面に細胞懸濁液の40 x 25 μL(= 250細胞)をスポットします。素早く滑らかな動きで蓋を回し、5mLのPBSが入ったそれぞれの細胞培養皿に置きます。
   1. 使用する細胞の種類に応じて、37°Cおよび5%CO₂の細胞インキュベーターで10〜14日間、「吊り下げ式ドロップディッシュ」を培養します
      手記：転移性黒色腫増殖期の細胞は、通常、放射状増殖期または垂直増殖期に由来する黒色腫細胞と比較して、垂れ下がった液滴でより速く増殖し、より固いスフェロイドを形成します。個々の評価には、双眼鏡または光学顕微鏡(4倍倍)でスフェロイドの成長を観察します。通常、スフェロイドは48時間後に双眼鏡または光学顕微鏡(4倍倍)で検出可能になります。10〜14日後、拡大装置なしで表示されます。
3. 最初の滴下スポッティングから5日後に、1滴ごとに10 μLの新鮮なRPMI/10% FCS培地を加えます。その後、1日おきに10μLの培地を交換します。このステップでは、電子ディスペンサーの使用が非常に役立ちます。
4. 細胞の種類にもよりますが、10〜15日後にスフェロイドを回収します。吊り下げ式ドロップセル培養皿の蓋からスフェロイドをPBSで慎重に洗い流します。10〜20個のスフェロイドを滅菌済みの非接着性細胞培養皿に集めます。パスツールピペットで余分なPBSを慎重に取り除きます.
   手記：培養期間は、メラノーマ細胞が最初に由来したときの腫瘍増殖期に依存し、例えば、451-LU細胞に由来するスフェロイドは、吊り下げ液中で培養してから12日以内に直径約500μmまで増殖します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
胎児血清アルブミン(FCS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10270106	細胞培養培地に10%を添加
トリプシン-EDTA	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25300054	PBSで1倍希釈
RPMI(ルプミ)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	61870010	メラノーマ細胞株の培養に

します。