器官型フルスキン再構築物の生成:ヒト皮膚サンプルを用いた3次元皮膚モデルの構築法

要約

出典:Müller, I. et al. 3D 器官型黒色腫スフェロイド皮膚モデル。J. Vis. Exp. (2018年)

このビデオでは、メラノーマの進行を研究するためのin vitro 3D器官型皮膚再構築物を生成するための詳細なプロトコルについて説明しています。この皮膚モデルは、in vivoでの臓器の構造と多細胞の複雑さの両方を模倣しています。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 表皮からの初代ケラチノサイトの単離

1. 表皮組織をPBSで洗います。表皮を細かく切り(1 mm²)、50 mLの円錐管に集めます。1x Trypsin-EDTA(37°Cに予熱)10 mLを加え、37°Cの水浴中で5分間インキュベートします。
2. 1 mLのウシ胎児血清(FCS)を添加して酵素反応を停止します。10 mLのプラスチックピペットで4分間ピペッティングして、細胞を再懸濁します。気泡や泡の形成を避けてください。
3. 細胞懸濁液を細胞ストレーナー(細孔径100 μm)にピペットで移し、新鮮な50 mLコニカルチューブの上に置き、5 mLのPBSで3回すすぎます。細胞を200 x gで5分間遠心分離します。細胞ペレットを1%(v / v)ゲンタマイシンを含む2〜6 mLの培養培地に再懸濁します。血球計算盤で細胞をカウントし、6 x 10⁵細胞をT75細胞培養フラスコに播種して、手動で細胞数を決定します。

2. 真皮からの一次線維芽細胞の分離

1. 真皮組織を小片(1 mm²)に切り、50 mLの円錐管に移します。10 mLのコラゲナーゼ溶液(PBS⁺で5 U/mL)を加え、37°Cの水浴で45分間インキュベートし、組織片と細胞の混合物を200 x gで5分間遠心分離します。
2. 細胞ペレットを4.5 g / LグルコースとL-グルタミンを含む10 mL DMEMで2回洗浄しますが、L-ピルビン酸は使用しません。.最後に、1%(v / v)ゲンタマイシンと10%FCSを含む2 mLのDMEMに組織片を再懸濁します。それらをT25細胞培養フラスコに移し、細胞インキュベーターで37°Cおよび5%_CO2で一晩インキュベートします.
   注:少量であるため、線維芽細胞が組織破片から移動し、培養フラスコに付着するように強制されます。
3. 翌朝、さらに6 mLのDMEM/ゲンタマイシン/FCSを加え、細胞の密度が80〜90%に達するまで37°Cで2〜3日間インキュベートします。

3. 器官型フルスキン再構築物の真皮コンパートメントの生成

1. 24ウェルプレートに配置した24ウェル細胞微多孔質メンブレンインサート(細孔径8μm)を使用して皮膚モデルを生成
   手記：吊り下げ式ではなく、立っているインサートは、後の段階で空気液培養のために6ウェルプレートに入れるため、使用しないでください。
2. ゲル中和液(GNL)、MMと呼ばれる培地、および内皮増殖培地(EGM)を調製します。凝固を防ぐため、I型コラーゲン(通常はラットテール由来、0.02N酢酸中3.5-4mg/mL)はRTでゲル化し始めるため、使用するまで氷上に保存します。
3. インサートあたり1 x 10⁵線維芽細胞をGNLに再懸濁し、細胞懸濁液とコラーゲンを1:3の比率で迅速に混合し、最終容量500 μL/インサートにします。泡が皮膚再建の品質を損なう可能性があるため、気泡の形成を避けるために、ゆっくりとピペッティングで上下させて混合します。
4. 個々の真皮ゲルを沈殿させるには、培地なしで滅菌フードに30分間RTで保管します。その後、各ゲルを4.5 g/Lグルコース、1% L-グルタミン、10% FCSを含むDMEMで覆い、L-ピルビン酸を含まない状態で覆い、37°Cで一晩インキュベートします。

4. 器官型フルスキン再構築物の表皮コンパートメントの生成

1. 翌日、培地を真皮ゲルから取り出し、EGM培地(10% FCS、1%ペンストレップ、10 mg/mLゲンタマイシン)で37 °Cで2時間平衡化します。培地を取り出し、1 x 10⁵ケラチノサイトを100 μL EGMに再懸濁した真皮ゲルの上に慎重に播種します。
2. 再構築物を37°Cで1.5時間インキュベートし、ケラチノサイトが真皮コンパートメントに付着することを確認します
   手記：このインキュベーション時間中、ゲルは線維芽細胞による収縮により収縮し始め、したがって、少なくとも部分的にインサート壁から剥離します。
3. 皮膚当量を約800μLのEGMで覆い、小さな(白い)ピペットチップでインサート壁から残留ゲルを慎重に取り除きます。皮膚当物をEGMに7日間沈め、細胞インキュベーターで37°C、5%CO₂で培養し、培地を隔日で交換します
   手記： この間、皮膚の同等物は大幅に縮小します。

>5. 器官型フルスキン再構築物の空気液培養

1. 8日目に、各インサートを6ウェルプレートの個々のウェルに移します。各ウェルに1.2〜1.4 mLのMM培地を追加するだけで、ウェルの底から皮膚再建物に培地が供給されますが、培地で覆われることはありません
   手記： 気液界面での培養により、表皮部分の層別化と完全な角質層(角質層)の確立が可能になります。
2. 次の10〜17日間は、セクション5.1に記載されているように、隔日で媒体を交換します。この期間中、必要に応じて薬物やその他の刺激を媒体に加えます。免疫組織化学分析などのさらなる分析のために、湾曲したピンセットを使用して、微多孔質膜インサートから完全な皮膚再構成物を慎重に取り出します(図1)。

結果

図1:培地に浸し、気液界面で3D器官型皮膚再構築物の培養。0日目に、初代ケラチノサイトは、I型コラーゲンマトリックスに埋め込まれた初代線維芽細胞からなる真皮コンパートメントの上に播種されます。3D皮膚再構築は、EGMで7日間水中で培養されたままで、挿入壁から剥がれ、縮小を開始します。8日目に、インサートを6ウェルに移し、気液界面で培養して表皮の層別化を可能にします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
胎児血清アルブミン(FCS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10270106	細胞培養培地に10%を添加
トリプシン-EDTA	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25300054	PBSで1倍希釈
DMEM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	41965062	初代線維芽細胞の培養に
ディスパーズ	Gibco のライフテクノロジー	17105041	2U/ml、PBSに溶解
I.型コラーゲン	BDバイオサイエンス	354249	通常、ラットテールから、濃度は3.5〜4 mg / mlである必要があります
24ウェルインサートNunclon	ヌンク	140629	8 μmの細孔サイズ、吊り下げ式インサートではなく立った状態で使用
セルストレーナー	BDファルコン	352360	黄色
ゲンタマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15750060	PBSに溶解
ケラライフ角質細胞中	細胞システム		FCSや抗生物質を追加しないでください
コラゲナーゼ	セルヴァ	17454	NB4標準グレード
若年性ヒトケラチノサイト	細胞システム	FC-0007	若年包皮からの独自の準備に代わるもの
若年性ヒト線維芽細胞	細胞システム	FC-0001	若年包皮からの独自の準備に代わるもの
EGFの	Gibco のライフテクノロジー	13247から051	EGM培地の生成のためだけに10ng / mlを追加します
塩化カルシウム	メルクケミカルズ	2381	EGMの生成には1.9 mM、MMミディアムの生成には3.8 mMを追加します
セレン酸	アルファ・アエサル	18851	EGMおよびMM媒体の生成に53nMを追加します
インスリン	リリー	HI0219 ハムペン 3ml 100 E.I./ml	EGMおよびMM培地の生成のために5μg/mlを添加します
エタノールアミン	シグマ・アルドリッチ	E-0135	EGMおよびMM培地の生成に0.1 mMを追加します
P-エタノールアミン	シグマ・アルドリッチ	品番 P-0503	EGMおよびMM培地の生成に0.1 mMを追加します
ホロトランスフェリン	シグマ・アルドリッチ	T-0665	EGMおよびMM培地の生成のために5μg/mlを添加します
トリヨードサイロニン	シグマ・アルドリッチ	T-6397	EGMとMM培地の生成に20pMを追加
ヒドロコルチゾン	シグマ・アルドリッチ	H-088816-J	EGMおよびMM培地の生成に0.4μg/mlを添加します
プロゲステロン	シグマ・アルドリッチ	P-8783	EGM培地の生成のためだけに10 nMを追加
ヘペス	シグマ・アルドリッチ	H-3784	EGMとMM培地の生成に15 mMを追加
セリン	シグマ・アルドリッチ	S-4311	EGMおよびMM培地の生成に1 mMを追加します
塩化コリン	シグマ・アルドリッチ	C-7017	EGMおよびMM培地の生成に0.64 mMを追加
dFCSの	シグマ・アルドリッチ	F-0392 ロット 086K0361	EGMとMM培地の生成に2%を追加します
アデニン	シグマ・アルドリッチ	A-9795	EGMおよびMM培地の生成に0.18 mMを追加
L-グルタミン	プロモセル	C-42209	EGMおよびMM媒体の生成に7.25 mMを追加
塩化ストロンチウム	シグマ・アルドリッチ	255521	EGMおよびMM培地の生成に1 mMを追加します

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