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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. B16-BL6細胞の調製
- 細胞培養プレートを37°インキュベーターから取り出し、滅菌フードに入れます。プレートは、B16-BL6マウス黒色腫細胞と約70%コンフルエントである必要があります。より大きなコンフルエンスにより、細胞の転移能が変化する可能性があります。
- プレートあたり1 mLの0.05%トリプシン-EDTAを加え、1分間放置してから、トリプシン培地溶液を吸引します。
- プレートあたり1 mLのトリプシンを加え、プレートをインキュベーターに10分間戻します。
- プレートをインキュベーターから滅菌フードに移動した後、各プレートに4 mLの無血清Rosewell Park Memorial Institute(RPMI)培地を追加します。.
- 滅菌済みの電動ピペットで細胞を採取します。先端をごくわずかな角度で押し付けて、プレートの底部に細胞を排出し、細胞をバラバラにします。数回繰り返して、駆出針を詰まらせる可能性のある細胞塊を適切に分離します。回収し、50mLのコニカルチューブに移します。
- 血球計算盤を使用して細胞密度を決定します。B16-BL6細胞の総数を一定に保ちながら、0、0.065、0.015、0.25、および50万細胞/mLの最終濃度に達するために必要な無血清RPMIの量を決定します。
- 50 mLチューブ内の培地を15 mLコニカルチューブに均等に分注します。コニカルチューブを2,250 x gで5分間遠心分離します。メディアをデカントします。適量の無血清RPMIを添加し、血球計算盤で目的の細胞密度を確認します。RPMIを追加するか、それに応じて少量で回転して再懸濁することにより、密度を調整します。
- 各細胞懸濁液500μLを氷上の標識1.8 mLチューブに分注します。
>2. 尾静脈注射
- 雌のC57BL/6マウス(6-8週齢)を1グループにつき5匹購入します。マウスが適応するまで数日待ちます。
- テールで保持されたマウスを取り、マウスの拘束具に後部からガイドします。胴体を拘束装置のメインチャンバーに、尾を外側に置き、マウスを拘束装置の端に向かって引きます。レストレインプランジャーを挿入し、マウスが固定されるまで押し続けます。
- マウスを90度回転させて、外側の尾静脈の1つが上を向くようにします。アルコールパッドを使用して、マウスの尾の側面、特に尾静脈が最も見える場所を精力的に清掃します。
手記：B57BL/6Jマウスで尾静脈を効果的に可視化するには、良好な照明が不可欠です。ヒートランプや加熱された手術用パッドは、必須ではありませんが、尾静脈のボリュームを増やすことでも役立ちます。
- 滅菌培養フードで、200万個の細胞/mLチューブから300μLの細胞培養培地を回収します。針を反転させ、側面をはじいてプランジャーを押すと、シリンジから気泡が排出されます。培養RPMIを取り出して、最終容量が250 μLになるようにします。
- 利き手ではない手でマウステールを伸ばします。利き手ではない手の人差し指で尾の近位端を持ち上げ、親指で尾の遠位部分を押し下げて尾を持ちます><。
手記：このようにして、尾静脈は拘束面と平行な横方向に保持され、尾のより遠位の部分に合同の侵入が可能になります。
- 針を尾静脈に、遠位端に向かって、最初に分を下向きの角度で挿入し、さらに挿入するときに尾静脈の角度に一致するように針を調整します(針に対してシリンジのプランジャー端を下げます)。
- 針を尾静脈に約1cm挿入します。挿入後、針をしっかりと保持しながらプランジャーを押し始めます
手記：針が尾静脈にあり、針の端が塞がれていない場合、媒体は妨げられることなく静脈に流れ込む必要があります。効果的な注射は、静脈からの血液クリアランスによって特徴付けられます。抵抗がある場合、または注射部位に気泡が形成され始めた場合は、針を取り外して、尾静脈に沿ったより近位の場所で再試行してください。
- 静脈から針を取り外して廃棄します。エントリーサイトにガーゼを当てて出血を防ぎます。
- プランジャーを拘束装置から取り外し、マウスをレシピエントケージに入れます。
- 他のすべての濃度についても繰り返します。
手記：肺病巣の確立には約2〜3週間かかり、細胞株と病巣の所望のサイズによって変動します。その間、マウスは、過度の喘ぎ声のような早期の安楽死を正当化する可能性のある症状がないか監視されるべきです。
3. 肺病巣の数え方
- マウスをCO2チャンバーに入れ、チャンバー容積の10〜30%で導入された100%CO2に5分間さらして、マウスを安楽死させます。
- 発泡スチロールでマウスを広げます。外科用ハサミを使用して、胸骨に沿って外科的切開を作成します。
- 胸骨の切開部の上部からマウスの肩に向かって分岐する2つの追加の切開を行い、胸郭を露出させます。
- 胸骨の外側に沿ってそれぞれ2つの切り込みを入れて、胸郭を胴体から取り出し、肺と心臓を露出させます。
- 外科用ピンセットで心臓を保持し、食道と気管を切断し、心臓と肺をマウスから解放します。10倍の倍率で解剖顕微鏡の下に置くと、視認性が向上します。
- 肺から心臓を解剖し、胸腺を切除し、2つの肺だけを残します。
- 解剖スコープの下に肺を置いて、肺の病巣を数え始めます。各病巣は、肺の表面に円形の茶色の目立たないものとして現れるはずです。
- マウス間の一貫性を保つために、葉の表面の病巣の数を数え、その葉を反転させます。4つのローブのそれぞれを個別に行うと、カウントが容易になります。
- IHCを実行する場合は肺を保存して固定し、そうでない場合は、残りを廃棄します。