HCR-DNA FISH:感染細胞中のウイルスDNAを検出するための蛍光In Situハイブリダイゼーション技術

要約

出典:Wei Liu et al., Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection, J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、MCPyVビリオンに感染した細胞をin situハイブリダイゼーション連鎖反応にかけ、MCPyV特異的なゲノムを検出しました。さらに、DNA-HCR技術をFISHと組み合わせて、感染したヒト皮膚細胞のMCPyV DNAを視覚化しました。

プロトコル

1. 感染

1. 10%のウシ胎児血清、1%の非必須アミノ酸、および1%のL-グルタミンを含むDMEMで、一次ヒト皮膚線維芽細胞を維持します。合流点に達すると、スピンダウンせずに線維芽細胞を1:4に分割します.
   手記：MCPyV感染効率を最大限に高めるには、播種時に活発に分裂している継代5と12の間の一次線維芽細胞を使用します。
2. ヒトの真皮線維芽細胞に感染するには、培地を吸引し、細胞をDPBSで洗浄します。
3. 0.05% Trypsin-EDTA1 mLをディッシュに加え、37°Cで5〜10分間インキュベー
トします。
4. 顕微鏡でチェックして、細胞が皿から出ていることを確認してください。
5. MCPyV感染を刺激する20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、および3 μM のCHIR99021を含むDMEM/F12培地10 mLをディッシュに加え、細胞溶液を15 mLチューブに移します。
6. 細胞を180 x gで2分間スピンダウンし、上清を捨てます。20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、および3 μM CHIR99021を含むDMEM/F12培地に細胞を2-4 x 10⁴細胞/mLで再懸濁します。
7. 1 mg/mL コラゲナーゼIV型を添加した細胞懸濁液200 μLを96ウェルプレートの各ウェルに播種します。MCPyVビリオンストックを氷上で解凍します。感染する細胞 2,500 から 5,000 個につき、iodixanol 1 μL あたり 10⁹ ウイルスゲノム相当の MCPyV ビリオンを添加します。プレートの側面を軽くたたいて、プレートをインキュベーターに入れます。
8. 37°Cで5%_CO2に48〜72時間インキュベートした後、各ウェルに20%FBSを添加します。
9. 感染を37°Cで5%CO₂中で72〜96時間進行させます。

2. in situ DNA-HCR

カバー
1. ガラスで培養した細胞をPBS中の4%PFAで10分間固定し、カバーガラスをPBSで2回洗浄し、70%エタノールで処理して細胞を4°Cで一晩透過処理します
   手記：固定サンプルは、この状態を数日間維持できます。
2. エタノールをプローブハイブリダイゼーションバッファーに置き換え、室温で60分間インキュベートすることにより、サンプルをプレハイブリダイズします。
3. プレハイブリダイゼーションステップ終了の30分前に、プローブ(1 μM)(表1)をプローブハイブリダイゼーション緩衝液で1:500希釈し、45°Cでインキュベートします。
4. インキュベーションの終了時に、希釈したプローブミックスをカバースリップごとに~10 μLピペットで顕微鏡スライドに貼り付けます。カバーガラスを細胞側を下にして、ハイブリダイゼーションプローブミックスのそれぞれの液滴の上に置きます。カバースリップの端と裏側をスライドにたっぷりとゴムセメントでシールします。
5. ヒートブロックの平らな面にスライドをセットすることにより、追加のプローブでスライドを94°Cで3分間加熱します。スライドを加湿チャンバーに移し、45°Cで一晩インキュベートします。簡単な加湿チャンバーを作成するには、滅菌ペーパータオルをdH₂Oで軽く湿らせ、ゴム製のガスケットで密封するプラスチック容器の底に置きます
   手記：加熱中、ゴムセメントは短時間泡立つことがあります。ただし、シールが壊れないように注意してください。
6. 鉗子でゴムセメントを慎重に剥がし、カバースリップをセル側を上にして24ウェルプレートのウェルに戻します。カバースリップをプローブ洗浄バッファーでRTで3回洗浄します。
7. カバーガラスを増幅バッファー(24ウェルプレート中200 μL)でRTで30〜60分間インキュベー
トします。
8. 一方、プローブを認識する2つの標識オリゴヌクレオチドヘアピン(表1)をそれぞれ別々のPCRチューブに入れ、94°Cで90秒間加熱し、RTまで30分間冷却しながら光から保護します。2つのヘアピンを増幅バッファーにそれぞれ1:50の希釈で混合します。
9. 24ウェルプレートの蓋の開放面にパラフィンフィルムを伸ばして、増幅反応のための表面を作ります。各カバースリップについて、ヘアピン/増幅バッファー混合物の50-100 μL液滴をパラフィンフィルム上にピペットで移します。鉗子を使用して、増幅前溶液からカバースリップを慎重に取り外します。多孔質の使い捨てワイプに端を触れてカバーガラスを乾かし、細胞側を下にして増幅液滴の上に置きます。
10. カバースリップを保持しているプレート蓋を加湿チャンバーに入れ、暗闇の中でRTで一晩インキュベートします。
11. カバースリップをもう一度ウェルに戻します。0.5 μg/mL DAPIを含む5x SSCT [5x 塩化ナトリウムクエン酸ナトリウム(SSC) 0.1% Tween 20 0.22 μmフィルターでろ過]でサンプルをRTで1時間インキュベートします。
12. カバースリップを顕微鏡スライドに取り付けます。細胞を解析し、倒立蛍光顕微鏡を使用してサンプルを画像化します。

MCPyVプローブ1	CCTCAACCTACCTCCAACTCCCATATTCGCTTC TAAAA tgagctacctcactaaggaaggagtgttttatactgcagtttcccccccccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTCTCACCCCTCAC
MCPyVプローブ2	CCTCAACCTACCTCCCAACTCCCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggctaggagccccaagcctctgccaacttgaaaaaaaaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTCTCTCCCTCAACTCTCAC
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MCPyVプローブ4	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCCATATTCGCTTC TAAAA gatactgccttttttgctaattaagcctcttaagcctctaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTCTCTC
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MCPyVプローブ9	CCTCAACCTACCTCCCAACTCTCCATATTCGCTTC TAAAA agcttcgggacccccccaaattttttcgctttcttgttggaatggaggaggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTCTCTCTC
MCPyVプローブ10	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtgtctgcggcttgttggcaaatggttttctgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPVプローブ1	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCCATATTCGCTTC TAAAA cagctctgtgcataactgtggtaactgtttctgggtcgctcctgtgggtcct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCCCTCAACTCTCAC
HPVプローブ2	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCCATATTCGCTTC TAAAA acaatattgtaatgggctctgtccggttctgcttgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPVプローブ3	CCTCAACCTACCTCCCAACTCTCCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtgtaagtccaaatgcagcaatacaccaatcgcaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCCACCCCTCAC
HPVプローブ 4	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggcggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPVプローブ5	CCTCAACCTACCTCCCAACTCTCCATATTCGCTTC TAAAA ccatccattacatcccgtaccctcttccccattggtcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTCTCTCTCCTCAACTCTCAC

表1:研究で使用したプローブ。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
プローブハイブリダイゼーションバッファ	分子技術
プローブ洗浄バッファー	分子技術
増幅バッファ	分子技術
Alexa 594 ラベル付きヘアピン	分子技術	B4	光から守る
パラホルムアルデヒド	シグマ	P6148