ヒト皮膚ケラチノサイト単離:皮膚サンプルから初代ケラチノサイトを培養する方法

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. ヒトの皮膚からのケラチノサイトの単離

1. 次の溶液を作ることから始めます:0.25%トリプシンと0.1%グルコースのDPBS溶液の50mL溶液。溶液を混合し、ろ過滅菌(0.2μm)します。10 mLのRPMI-1640 + 2% FBS溶液、50 mLのDPBS、およびケラチノサイト無血清培地(KSFM)を調製します。KSFMサプリメントと250μLのゲンタマイシンを500mLのKSFMに加えます。使用前に溶液を37°Cに予温してください。
2. 整形手術を受けている健康な成人ボランティアから皮膚を採取します。使用される皮膚サンプルは約10cm×15cmですが、サイズは異なる場合があります。輸送中は、冷却要素が入った発泡スチロールの箱で皮膚サンプルを輸送することにより、皮膚を涼しく保ちます。必要に応じて、皮膚サンプルを4°Cで一晩保存できます。
3. 滅菌したハサミ、メス、鉗子を使用して、皮膚部分の下から脂肪を取り除きます。
4. 針を使用して、プレートの上にある滅菌カバーの上で皮膚部分(約10 cm x 15 cm)をバックルで締めます。まず、乾燥した滅菌済みガーゼパッドで肌をきれいにします。次に、70%エタノールで滅菌したガーゼパッドを使用して皮膚をきれいにします。
5. フットプレーナーを使用して、皮膚部分の上層(表皮)を切り取り、9cmのシャーレに入れます。次に、すぐに25 mLのDPBS /トリプシン/グルコース溶液(ステップ1.1で調製)をペトリ皿に加えます。.37°Cで30分間インキュベートします。
6. ピペットを使用して、DPBS /トリプシン/グルコース溶液をペトリ皿から取り出し、10 mLのRPMI-1640 + 2%FBSを追加してトリプシンを不活性化します。.
7. 2つの鉗子を使用して、皮膚部分の表皮と真皮コンパートメントの両方を穏やかにこすり、攪拌することにより、表皮細胞を培地に放出します。
8. 表皮細胞懸濁液を金属フィルター(1 mmの穴サイズ)でろ過し、50 mLチューブに収集します。残りの皮膚切片を、10 mLのRPMI-1640をFBSなしで入れた50 mLチューブに加え、10秒間ボルテックスします。懸濁液を金属フィルターでろ過し、表皮細胞懸濁液を含む50mLチューブに入れます。DPBSを総容量50mLまで添加します。
9. 細胞懸濁液を室温で450 x gで10分間遠心分離します。
10. 上清を取り除き、細胞ペレットのサイズに応じて、表皮細胞ペレットを約10 mLの37°C KSFMに再懸濁します。顕微鏡下でトリパンブルー染色法を使用して細胞をカウントします。10cm×15cmの皮膚切片から得られる細胞の数は、約50〜100×10⁶細胞である。各75 cm²培養フラスコに、8 x 10⁶細胞を12 mLの37 °C KSFMとともに移します。培養フラスコを静かに振って、細胞が均一に分布するようにします。
11. ケラチノサイトを37°Cのインキュベーターで、湿度100%、_CO25%でインキュベートします。2日後、週に3回、培地を交換してください。培養が70〜80%コンフルエントの場合の継代細胞は、ケラチノサイトの増殖速度にもよりますが、約2週間かかります。