黒色腫幹細胞の単離:磁気活性化細胞選別を使用してCD133陽性および陰性黒色腫細胞を取得する方法

要約

出典:Welte, Y. et al. 患者由来の細胞培養とメラノーマからのCD133+推定がん幹細胞の単離。J. Vis. Exp.(2013年)

このビデオでは、磁気活性化細胞ソーティングを使用して初代黒色腫細胞株からCD133陰性および陽性黒色腫幹細胞を単離する技術について説明しています。CD133陽性黒色腫CSCは、黒色腫腫瘍形成のメカニズムを理解するためにさらに研究されています。

プロトコル

1. LSカラムを用いたCD133⁺およびCD133^-メラノーマ細胞の磁気細胞選別

1. PBS中に2 mM EDTAと5% FCSを含むMACSバッファーを調製します。0.22 μm Steritop-GPフィルターユニットを使用して、インバーティングおよび滅菌濾液バッファーにより混合します。バッファーを4〜8°Cに冷却し、使用前に脱気します。
2. Accutase、PBS、およびQuantum 263培地を37°Cに予温します。
3. 80%コンフルエントセルをPBSで洗浄します。適量のアキュターゼを添加し、細胞が培養表面から剥離するまでインキュベートします。Quantum 263培地を使用して、50 mLチューブに細胞を回収します。
4. 細胞数を決定し、必要な数の細胞を300 x gおよび4-8°Cで5分間遠心分離します(Miltenyiのプロトコルによれば、LSカラムごとに最大2x 10⁹個の細胞をロードできます。細胞株固有の最適数を決定する必要があり、かなり低くすることができます。上清を完全に吸引します。
5. 最大 1x 10^{個の 8} 個の細胞を 350 μL MACS バッファーで再懸濁します (細胞数が多い場合は、後続のすべての MACS バッファー、FcR ブロッキング試薬、CD133/1-ビオチン、および抗ビオチン MicroBeads の量をそれに応じてスケールアップします)。
6. 100 μL FcR ブロッキング試薬を添加します。
7. 50 μL CD133/1-ビオチンを添加します。ボルテックスを使用してよく混合し、4〜8°Cで10分間インキュベートします。
8. 10 mLのMACSバッファーを加えて細胞を洗浄し、300 x gおよび4-8°Cで5分間遠心分離します。
9. 洗浄手順(1.8)を繰り返します。
10. 細胞ペレットを400 μL MACSバッファーで再懸濁します。
11. 100 μLの抗ビオチンマイクロビーズを添加します。ボルテックスを使用してよく混合し、4〜8°Cで15分間インキュベートします。
12. その間、磁気分離のためにMACSセパレーターを準備します。QuadroMACSをMACSセパレーターマルチスタンドに取り付けます。カラムウィング付きのLSカラムを、QuadroMACSの磁場の前方に挿入します。Pre-Separation Filter(30 μm ナイロンメッシュ付き)を各LSカラムにセットし、各カラムの下に適切なコレクションチューブ(15 mLまたは50 mL)をセットします。フィルターとカラムを3 mL MACSバッファーですすいで調製します。フロースルーを破棄します。
13. 10 mLのMACSバッファーを加えて細胞を洗浄し、300 x gおよび4-8°Cで5分間遠心分離します。
14. 500 μL MACSバッファーで細胞を再懸濁し、Pre-Separation Filterを使用してLSカラムに細胞懸濁液を塗布します。
15. カラムあたり3 mLのMACSバッファーで3回洗浄します。新しいバッファーは、カラムリザーバーが空の場合にのみ追加してください。
16. 収集された総排水には、ラベルのないCD133^-細胞画分が含まれています。
17. プレセパレーションフィルターを廃棄し、カラムをセパレーターから取り外して、適切な収集チューブに置きます。
18. 5 mLのMACS緩衝液を塗布します。すぐにプランジャーをカラムにしっかりと押し込んで、標識されたCD133⁺細胞を洗い流します。
19. ネガティブフラクションの純度を上げるには、QuadroMACSに挿入した新しい平衡LSカラムに細胞懸濁液を塗布します。廃液にはCD133^-画分が含まれています。
20. 列を破棄します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アキュターゼ	PAAラボラトリーズGmbH	L11-007
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩脱水物(EDTA)	シグマ・アルドリッチ(株)	E-7889
CD133/1 (W6B3C1)	ミルテニーバイオテックGmbH	〒130-092-395
間接CD133マイクロビーズキットヒト	ミルテニーバイオテックGmbH	〒130-091-895	含まれるもの:CD133/1(AC133)-ビオチン、抗ビオチンマイクロビーズ、FcRブロッキング試薬
クォンタム263	PAAラボラトリーズGmbH	U15-815
MACSセパレーターマルチスタンド	ミルテニーバイオテックGmbH	〒130-042-303
MACSセパレーションカラム 25 LSカラム	ミルテニーバイオテックGmbH	〒130-042-401
QuadroMACS セパレータ	ミルテニーバイオテックGmbH	〒130-090-976