黒色腫幹細胞の単離:磁気活性化細胞選別を使用してCD133陽性および陰性黒色腫細胞を取得する方法

1. LSカラムを用いたCD133⁺およびCD133^-メラノーマ細胞の磁気細胞選別

1. PBS中に2 mM EDTAと5% FCSを含むMACSバッファーを調製します。0.22 μm Steritop-GPフィルターユニットを使用して、インバーティングおよび滅菌濾液バッファーにより混合します。バッファーを4〜8°Cに冷却し、使用前に脱気します。
2. Accutase、PBS、およびQuantum 263培地を37°Cに予温します。
3. 80%コンフルエントセルをPBSで洗浄します。適量のアキュターゼを添加し、細胞が培養表面から剥離するまでインキュベートします。Quantum 263培地を使用して、50 mLチューブに細胞を回収します。
4. 細胞数を決定し、必要な数の細胞を300 x gおよび4-8°Cで5分間遠心分離します(Miltenyiのプロトコルによれば、LSカラムごとに最大2x 10⁹個の細胞をロードできます。細胞株固有の最適数を決定する必要があり、かなり低くすることができます。上清を完全に吸引します。
5. 最大 1x 10^{個の 8} 個の細胞を 350 μL MACS バッファーで再懸濁します (細胞数が多い場合は、後続のすべての MACS バッファー、FcR ブロッキング試薬、CD133/1-ビオチン、および抗ビオチン MicroBeads の量をそれに応じてスケールアップします)。
6. 100 μL FcR ブロッキング試薬を添加します。
7. 50 μL CD133/1-ビオチンを添加します。ボルテックスを使用してよく混合し、4〜8°Cで10分間インキュベートします。
8. 10 mLのMACSバッファーを加えて細胞を洗浄し、300 x gおよび4-8°Cで5分間遠心分離します。
9. 洗浄手順(1.8)を繰り返します。
10. 細胞ペレットを400 μL MACSバッファーで再懸濁します。
11. 100 μLの抗ビオチンマイクロビーズを添加します。ボルテックスを使用してよく混合し、4〜8°Cで15分間インキュベートします。
12. その間、磁気分離のためにMACSセパレーターを準備します。QuadroMACSをMACSセパレーターマルチスタンドに取り付けます。カラムウィング付きのLSカラムを、QuadroMACSの磁場の前方に挿入します。Pre-Separation Filter(30 μm ナイロンメッシュ付き)を各LSカラムにセットし、各カラムの下に適切なコレクションチューブ(15 mLまたは50 mL)をセットします。フィルターとカラムを3 mL MACSバッファーですすいで調製します。フロースルーを破棄します。
13. 10 mLのMACSバッファーを加えて細胞を洗浄し、300 x gおよび4-8°Cで5分間遠心分離します。
14. 500 μL MACSバッファーで細胞を再懸濁し、Pre-Separation Filterを使用してLSカラムに細胞懸濁液を塗布します。
15. カラムあたり3 mLのMACSバッファーで3回洗浄します。新しいバッファーは、カラムリザーバーが空の場合にのみ追加してください。
16. 収集された総排水には、ラベルのないCD133^-細胞画分が含まれています。
17. プレセパレーションフィルターを廃棄し、カラムをセパレーターから取り外して、適切な収集チューブに置きます。
18. 5 mLのMACS緩衝液を塗布します。すぐにプランジャーをカラムにしっかりと押し込んで、標識されたCD133⁺細胞を洗い流します。
19. ネガティブフラクションの純度を上げるには、QuadroMACSに挿入した新しい平衡LSカラムに細胞懸濁液を塗布します。廃液にはCD133^-画分が含まれています。
20. 列を破棄します。