化学的に誘発された2段階皮膚発がんモデル:皮膚癌の実験的In vivoマウスモデル

要約

出典:Vähätupa, M. et al. ジメチルベンズ[a]アントラセンと12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート(DMBA-TPA)を使用した化学誘発性皮膚発がんモデル。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、化学物質の局所適用による腫瘍開始を研究するために、2段階の皮膚発がんを誘発する手順を説明しています。最初のステップでは、変異原であるDMBAをマウスモデルの皮膚に適用して、幹細胞に変異を引き起こすことで腫瘍形成を開始し、続いて成長刺激剤であるTPAを適用して皮膚乳頭腫の形成を促進します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 実験動物、試薬、および機器

1. 年齢と性別が一致したマウスを使用してください。ほとんどのマウスの皮膚はその年齢の前後で休止期(休止期)にあるため、7〜9週齢で研究を開始します。
2. 研究中に動物の行動を観察し、彼らが戦う場合は、男性によく起こりますが、別々に飼いましょう。喧嘩は皮膚に切り傷を引き起こす可能性があり、腫瘍の形成を促進します。雌マウスは、攻撃的な行動が少ないため、好まれます。典型的な実験グループのサイズは、グループごとに8〜20匹の間で変動します.
   手記：以前の研究で見られた生物学的分散に基づく検出力の計算は、十分に大きなグループサイズを選択するのに役立ちます。本稿で例として使用している株には、Balb/cとC57BL/6があります。しかし、SENCARやFVBなど、他の多くのマウス系統がDMBA-TPAモデル、Wistarラット、Sprague-Dawleyラットに使用されています。研究を開始する前に、動物研究の国または地方の委員会からのライセンスが必要です。一般的な福祉上の考慮事項に加えて、モデル固有のエンドポイントは通常、扁平上皮がん(SCC)と皮膚の感染です。アセトンの腫瘍性化学物質を塗布した後のかゆみによる皮膚の引っかき傷が典型的ですが、そうでなければ、動物は不快感の兆候を示さないはずです。定期的な体重測定(例:月に2回)は、動物の福祉を評価するのに役立ちます。
3. DMBAとTPAは、どちらもアセトンで希釈したものを使用してください。DMBAの使用濃度は250 g / Lです。1匹の動物の用量は、200μLのアセトン中に50μgのDMBAです。TPAの原液濃度は125g/L、処理濃度は25g/Lです。1匹の動物のTPA用量は、200μLのアセトンで5μgです
   注意:DMBAは飲み込むと有害であり、癌を引き起こす可能性があります。アセトンは急速に蒸発し、可燃性です。めまいを引き起こし、目を刺激することがあります。呼吸マスクを使用するか、真空流下で作業します。これらの化学物質のいずれかを扱った後は、手袋を交換してください。個別に換気されたケージは、マウスの飼育中に化学物質が広がるのを防ぎます。塗布後、DMBAの取り扱いに使用したピペットチップを採取し、危険廃棄物として捨ててください
   手記：DMBAは光から保護する必要があります。希釈したTPAは-20°Cで保存し、できれば光から保護します。
4. 秤、毛皮用の普通のシェーバー、適当な大きさのピペットや先端、普通の定規、デジタルカメラ、メモ帳、乳頭腫を記録するためのペンやパソコン、吸い込み麻酔器や背中の上部に開口部のあるマウス拘束具、マウスを生贄にするための炭酸ガス麻薬システムなどを調達してください。

2. 皮膚乳頭腫の誘発と促進

1. 背中の皮膚を剃り、動物の体重を量ります。後で、必要なときはいつでも皮膚を剃りますが、化学物質にさらされたときは剃りません.
   手記：乳頭腫の周りを剃るときは注意し、皮膚に切り傷を作らないようにしてください。2週間ごとに各動物の体重を量り、体重減少の可能性に注意してください。
2. 毛皮を剃った48時間後にピペットを使用して、200μLのアセトンに50μgのDMBAを剃毛領域に局所的に塗布します。必要に応じて、軽い吸入麻酔またはマウスの拘束具を使用して動物を拘束します。
3. 7日後、最初のTPA投与を行います。200 μL のアセトンに 5 μg の TPA を週に 2 回、できれば月曜日と木曜日、または火曜日と金曜日にピペットで局所的に塗布します。
4. 毎週乳頭腫を数え、記録し、写真を撮ります。直径1mmを超える触知可能な腫瘤は、1週間以上滞在する場合、乳頭腫と見なされます。地図上に個々の乳頭腫をマークし、毎週そのサイズをリストアップします—デジタル写真を保存します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
7,12-ジメチルベンズ[a]アントラセン(DMBA)	シグマ	D3254-100MG	飲み込むと有害で、がんの原因となることがあります。光から保護して保管してください。
アセトン	シグマ	1000141011	急速に蒸発し、引火性です。
アタネ獣医1000mg / g	ピラマル・クリティカル・ケア・リミテッド		吸入用液体イソフルラン
電池式クリッパー Isis	アルバート・ケルブGmbH	GT421	毛皮を剃るのに
コントラフルランレストガスフィルター	ゼオシスGmbH		麻酔用
リネックスネイチャーN1030定規30cm	ステープルズビジネスアドバンテージ	60383	乳頭腫の測定に
タクタピペット 100-1000 ul	ザルトリウス	LH-729070
タクタピペット 20-200 ul	ザルトリウス	LH-729060
ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート別名12-オテトラデカノイルホルボール-13-アセテート(TPA)	エンツォ	BML-PE160-0001
メカソフト	メカラシ	23008	テーブルカバー
精密天びん PLJ-C/PLJ-G	KERN & SOHN GmbH	PLJの600-3CM
マウス (Balb/c JRj)	ジャンヴィエ研究所		他の株も可能
マウス(C57BL/6JRj)	ジャンヴィエ研究所		他の株も可能
パナソニックLumixDMC-FS5デジタルカメラ	パナソニック

の 型 (英語)