出典:Murphy, B. M. et al. 初代マウスメラノサイトおよび線維芽細胞培養物の迅速な生成。J. Vis. Exp. (2019年)
このビデオでは、出生後のマウスの子犬の皮膚からメラノサイトと線維芽細胞を同時に分離して培養する迅速な方法を説明しています。これらの細胞は、in vitroで維持および操作して、皮膚細胞生物学、創傷治癒、および黒色腫を研究することができます。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
方法論記事
初代マウスメラノサイトおよび線維芽細胞の迅速培養:マウス皮膚サンプル全体からのメラノサイトおよび線維芽細胞の単離
1.8K 閲覧数
⸱
2023年4月30日
この記事について
要約
プロトコル
動物が関わるすべての手続きは、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. メラノサイトと線維芽細胞の分離
- 生後0〜4日の雄および/または雌のC57Bl/6Jの子犬を斬首して安楽死させ、手術用ハサミを使用して安楽死させたマウスから四肢を切除します。
- 層流キャビネットで、70%エタノールを含む滅菌ペトリ皿で各マウスの体幹を短時間転がします。エタノールからトランクを取り出し、空の滅菌済みペトリ皿に入れます。
- 70%エタノールで滅菌した外科用ハサミを使用して、首から尾まで胴体の腹側の皮膚を切開します。滅菌鉗子を使用してマウスの体幹から皮膚をはがします。
- 3 mLの1x Antibiotic/Antimycotic solutionを含む6ウェル皿に、真皮を下にして皮膚を置き、室温で2〜3分間インキュベートします。
- 次の設定を行った状態でティッシュチョッパーをオンにします:スライスの厚さ:1μm;ブレード力:最大~60%。速度:最大速度の~50%。
- 真皮を下にして皮膚を滅菌組織チョッパーディスクに移し、活性化組織チョッパーに皮膚を3回完全に通過させます。.
- 均質化された皮膚を、3 mLの皮膚消化バッファーを含む滅菌済みの15 mLコニカルチューブに移します(10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、1%L-グルタミン、10 mg / mLコラゲナーゼI型、0.25%ブタトリプシン、0.02 mg / mLデオキシリボヌクレアーゼIを含む3 mLの新鮮な皮膚消化バッファーを準備しますRPMI 1640で)。得られた懸濁液をP1000マイクロピペットで10〜15回ピペッティングして混合します。
- コニカルチューブにキャップをし、サンプルを37°Cのウォーターバスで15分間インキュベートし、チューブを3〜5分ごとに反転させます。
- コニカルチューブをスイングバケツローターで750 x gの室温で5分間遠心分離することにより、皮膚ホモジネート中の細胞をペレット 化します。
- P1000マイクロピペットを使用して、ペレットを乱さないように注意しながら、Skin Digestion Bufferをゆっくりと完全に取り出します
手記： この段階で皮膚全体の一部を保存し、細胞の純度を確認するためのコントロールとして使用できます。これらの細胞を70μmのセルストレーナーで濾し、さらにプロセスします。 - P1000マイクロピペットで15〜20回ピペッティングして、細胞ペレットを1 mLのメラノサイト培地に完全に再懸濁します。得られた細胞溶液を、1 mLのメラノサイト培地を含む6ウェルディッシュのコーティングされていないウェルに滴下します。
- めっきした皮膚ホモジネートを、37°C、5%CO2に設定した組織培養インキュベーターに入れます。培養物を40分間インキュベートします.
手記：この間、皮膚ホモジネート中の一部の線維芽細胞はコーティングされていない皿に付着しますが、メラノサイトとケラチノサイトは懸濁液のままです。 - 培養上清をコーティングされていないディッシュから、事前に洗浄したコラーゲンコーティングされた6ウェルディッシュの1ウェルに移します。最終濃度が100 ng/mLになるようにG418を培地に加えます。
- 2 mLの線維芽細胞培地を、付着性線維芽細胞を含む未コーティング皿の1ウェルに加えます。
- 両方の培養物を、37°Cおよび5%CO2に設定された組織培養インキュベーターで一晩インキュベートします。
- 各培養物からのメディアと破片を別々に吸引します、めっき後16〜24時間。各皿を1 mLの滅菌PBSで2回洗浄し、次に2 mLの新鮮なメラノサイト培地と100 ng / mL G418をメラノサイト培養物に加え、2 mLの新鮮な線維芽細胞培地を線維芽細胞培養物に加えます。(栄養ミックスF-12ハム培地に10%ウシ胎児血清、7%ウマ血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、1%L-グルタミン、0.5 mMジブチリル環状増幅(dbcAMP)、20 nMテトラデカノイルホルボール13-酢酸(TPA)、および200 pMコレラ毒素(CT)を含む6 mLの新鮮なメラノサイト培地を調製します><。
注:濃縮されたdbcAMP、TPA、およびCTストック溶液は、-80°Cで>1年間製造、分注、保存することができます。これらの成分を欠くベース培地は、4°Cで最大1ヶ月間保存できます
10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および1%L-グルタミンを含む4mLの線維芽細胞培地をDulbeccoのModified Eagle Mediumに調製します。この培地は4°Cで最大1ヶ月間保存できます) - メラノサイト培養物をG418で48時間処理した後、細胞を1mLの滅菌PBSで2回洗浄し、G418を含まない2mLの新鮮なメラノサイト培地を培養物に加えます。
手記： メラノサイト培養中の線維芽細胞はG418処理後も死滅し続けるため、滅菌PBSで皿を洗浄して死んだ細胞を取り除き、新鮮なメラノサイト培地を追加します。メラノサイトと線維芽細胞の培養物は、70〜80%のコンフルエントに達したときに継代する必要があります。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| エタノール、200プルーフ | フィッシャーサイエンティフィック | 22032601 | |
| 抗生物質抗真菌剤溶液(100倍) | シグマ・アルドリッチ | A5955 | |
| マキルウェインティッシュチョッパー | テッド・ペラ | 10180 | |
| ティッシュチョッパーブレード | テッド・ペラ | 121から6 | |
| ティッシュチョッパープラスチックディスク | テッド・ペラ | 10180-01 | |
| コラゲナーゼI型 | ワージントンバイオケミカルズ | LS004156 | |
| ブタトリプシン | シグマ・アルドリッチ | 85450°C | |
| トリプシン | VWRの | VWRL0154-0100 | |
| G418ジスルフィド | P212121 | LGB-418から1 | |
| ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム | ギブコ | 〒12800-082 | |
| RPMI 1640 のメディア | シグマ・アルドリッチ | R8758 | |
| ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 | シグマ・アルドリッチ | D8537 | |
| 6ウェル細胞培養皿 | シグマ・アルドリッチ | SIAL0516 | |
| 5 mLポリスチレン丸底チューブ | フィッシャーサイエンティフィック | 352008 | |
| 10cm細胞培養皿 | コーニング | 430167 | |
| ウシ血清アルブミン | フィッシャーサイエンティフィック | BP9706-100 | |
| ウシ胎児血清 | シグマ・アルドリッチ | 12306C | |
| コーニングペニシリン/ストレプトマイシン溶液 | フィッシャーサイエンティフィック | 30-002-CL | |
| ニュートリエントミックス F-12 ハムのメディア | シグマ・アルドリッチ | N6760 | |
| ラットテール由来のコラーゲン | シグマ・アルドリッチ | C7661 | |
| 0.2 μm PES 滅菌シリンジフィルター | VWRの | 28145-501 | |
| 40 μmセルストレーナー | フィッシャーサイエンティフィック | 22363547 | |
| 70 μmセルストレーナー | フィッシャーサイエンティフィック | 22363548 | |
| コレラ毒素 | シグマ・アルドリッチ | C8052 | |
| ホースセラム | フィッシャーサイエンティフィック | 26050088 | |
| ハイクローン L-グルタミン | フィッシャーサイエンティフィック | SH3003402 |
タグ
