組換えメルケル細胞ポリオーマウイルス(MCPyV)ビリオン調製:高力価組換えMCPyVビリオンを作製する技術

要約

出典:Wei Liu et al. メルケル細胞ポリオーマウイルス感染と検出, J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、273TT細胞を使用したメルケル細胞ポリオーマウイルスまたはMCPyVビリオンの調製を示しています。この技術は、組換えMCPyVビリオンの高力価を生成するのに役立ちます。

プロトコル

1. 組換えMCPyVウイルスの準備

1. 50 μgのpR17bプラスミド(MCPyVゲノムを運ぶ)と250 UのBamHI-HFを200 μLの容量(37°Cで4時間)で消化し、ウイルスゲノムをベクターバックボーンから分離します(図1)。
2. 1200 μLのバッファーPB(10 μLの3 M NaAc、pH 5.2を添加)を消化したDNAに加え、2つのminiprepスピンカラム(20 μgのDNA容量)を精製します。消化したpR17bプラスミドを200 μLのTEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH8.0、1 mM EDTA)で各カラムから溶出します。
3. ライゲーション反応を50 mLの遠心チューブで調製します。ステップ1.2から精製したプラスミドDNA400 μL、1.05x T4リガーゼバッファー8.6 mL、高濃度T4リガーゼ6 μLを添加します。16°Cで一晩インキュベートします。
4. 45 mLのバッファーPB(10 μLの3 M NaAc、pH 5.2を添加)をライゲーションに加え、真空マニホールドを使用して2つのminiprepスピンカラムにロードします。各カラムを 50 μL の TE バッファーで溶出します。約30μgのDNA収量が期待できます。
5. 午後遅く/夕方に、6 x 10⁶ 293TT細胞を、10%のウシ胎児血清、....

結果

図 1.組換えウイルスゲノムを用いたMCPyVウイルスの作製(A)pR17b(MCPyVゲノムプラスミド)のプラスミドマップ。(B)グラジエントで採取および精製されたMCPyVビリオンサンプルの代表的な写真。矢印は、グラジエントのコアに集中したMCPyVビリオンのバンドを示します。(C)各グラジエント画分のウイルスゲノムコピー数をqPCRを用いて定量した。コア グラディエントの分数 (グラディエントの上から数えてグラフの下部に数値を示します)。エラーバーは、3つのテクニカルリピートの平均(S.E.M.)の標準誤差を表します。

....

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM/F12 ミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11330-032
組換えヒトEGFタンパク質、CF	研究開発体制	236-EG-200	摂氏-80度で保管
CHIR99021	ケイマンケミカル	13122	摂氏-80度で保管
CHIR99021	シグマ	SML1046	摂氏-80度で保管
コラゲナーゼIV型	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17104019
ディスパーゼII	ロシュ	4942078001
抗生物質-抗真菌薬	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15240-062	光からの保護
DMEM媒体	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11965084
パラホルムアルデヒド	シグマ	P6148
アンチMCPyV LT(CM2B4)	サンタクルス	SC-136172	ロット#B2717
MCV VP1 ウサギ		ウサギポリクローナル血清 #10965	https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm

してください してください してください 型