組換えメルケル細胞ポリオーマウイルス(MCPyV)ビリオン調製:高力価組換えMCPyVビリオンを作製する技術

要約

出典:Wei Liu et al. メルケル細胞ポリオーマウイルス感染と検出, J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、273TT細胞を使用したメルケル細胞ポリオーマウイルスまたはMCPyVビリオンの調製を示しています。この技術は、組換えMCPyVビリオンの高力価を生成するのに役立ちます。

プロトコル

1. 組換えMCPyVウイルスの準備

1. 50 μgのpR17bプラスミド(MCPyVゲノムを運ぶ)と250 UのBamHI-HFを200 μLの容量(37°Cで4時間)で消化し、ウイルスゲノムをベクターバックボーンから分離します(図1)。
2. 1200 μLのバッファーPB(10 μLの3 M NaAc、pH 5.2を添加)を消化したDNAに加え、2つのminiprepスピンカラム(20 μgのDNA容量)を精製します。消化したpR17bプラスミドを200 μLのTEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH8.0、1 mM EDTA)で各カラムから溶出します。
3. ライゲーション反応を50 mLの遠心チューブで調製します。ステップ1.2から精製したプラスミドDNA400 μL、1.05x T4リガーゼバッファー8.6 mL、高濃度T4リガーゼ6 μLを添加します。16°Cで一晩インキュベートします。
4. 45 mLのバッファーPB(10 μLの3 M NaAc、pH 5.2を添加)をライゲーションに加え、真空マニホールドを使用して2つのminiprepスピンカラムにロードします。各カラムを 50 μL の TE バッファーで溶出します。約30μgのDNA収量が期待できます。
5. 午後遅く/夕方に、6 x 10⁶ 293TT細胞を、10%のウシ胎児血清、1%の非必須アミノ酸、およびハイグロマイシンBを含まない1%L-グルタミンを補給したDMEM培地を含む10cm皿に播種します。
6. 翌朝、細胞が約50%コンフルエントであることを確認します。66 μL のトランスフェクション試薬 (1.1 μL/cm²)、ステップ 1.4 から 12 μg の再ライゲーションされた MCPyV 単離 R17b DNA、8.4 μg の ST 発現プラスミド pMtB および 9.6 μg の LT 発現プラスミド pADL を使用してトランスフェクションします。
7. トランスフェクションされた細胞がほぼコンフルエントになったら、翌日、細胞をトリプシン化し、15cmのディッシュに移して拡大を続けます。
8. オプションで、増殖時に少数の293TT細胞を採取し、MCPyV LT(CM2B4)およびVP1(MCV VP1ウサギ)のIF染色を実施して、トランスフェクション効率を決定します。この段階では、核LT信号は見えるかもしれませんが、VP1発現はおそらく検出できないでしょう。
9. 15 cmディッシュがほぼコンフルエントになったら(通常、最初のトランスフェクションから5〜6日後)、細胞を3つの15 cmディッシュに移します。15cmの皿から細胞を採取し、それらがほぼコンフルエントになったら、以下のウイルス採取プロトコルに従ってください
   手記：オプションで、ステップ 1.8 で説明されているように品質管理 IF を実行します。この段階では、ほとんどの細胞がMCPyV LTとVP1陽性の両方であるべきです。
10. ウイルスを回収するには、細胞をトリプシン化し、RTで180 x gで5分間回転し、上清を取り除きます。DPBS-Mg(9.5 mM MgCl₂および1x抗生物質-抗真菌薬を含むDPBS)の細胞ペレット1容量を追加します。次に、25 mMの硫酸アンモニウム(1 M pH 9ストック溶液から)を加え、続いて0.5%Triton X-100(10%ストック溶液から)、0.1%ベンゾナーゼ、および0.1%のATP依存性DNaseを添加します。よく混ぜ合わせ、37°Cで一晩インキュベートします。
11. 混合物を氷上で15分間インキュベートし、次に0.17容量の5M NaClを加えます。混合し、さらに15分間氷上でインキュベートします。4°Cの遠心分離機で12,000 x gで10分間遠心します。上清が透明でない場合は、チューブを静かに反転させ、回転ステップを繰り返します。上清を新しいチューブに移します。
12. 0.8 M NaClを添加した1容量のDPBSを使用してペレットを再懸濁し、ステップ1.11で説明したように再度遠心します。
13. ステップ 1.11 と 1.12 の上清を結合し、ステップ 1.11 の説明に従ってもう一度回転させます。
14. 長い針またはp1000ピペットを取り付けた3 mLシリンジを使用して、下敷き(27%、次に33%、次に39%)~0.7 mLステップで、薄肉5 mLポリアロマーチューブにヨージオキサノールのグラジエントを注ぎます。
15. 調製したiodixanolの勾配に3 mLの清澄化したウイルス含有上清をロードします。
16. SW55tiローターで234,000 x g、16°Cで3.5時間回転します。加速と減速を低速に設定します。
17. 超遠心分離後、シリコン処理チューブに12個のフラクションを回収します(各フラクションは~400 μLです)。
18. dsDNA試薬および/またはVP1(MCV VP1ウサギ)のウェスタンブロットにより、ウイルスの存在について画分を分析します。ピークdsDNAおよび/またはVP1含有量を持つグラジエントフラクションをプールし、定量的PCRによってストックを特性評価して、ウイルスゲノム当量を計算します。MCPyVビリオンストックは-80°Cで保存してください。

結果

図 1.組換えウイルスゲノムを用いたMCPyVウイルスの作製(A)pR17b(MCPyVゲノムプラスミド)のプラスミドマップ。(B)グラジエントで採取および精製されたMCPyVビリオンサンプルの代表的な写真。矢印は、グラジエントのコアに集中したMCPyVビリオンのバンドを示します。(C)各グラジエント画分のウイルスゲノムコピー数をqPCRを用いて定量した。コア グラディエントの分数 (グラディエントの上から数えてグラフの下部に数値を示します)。エラーバーは、3つのテクニカルリピートの平均(S.E.M.)の標準誤差を表します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM/F12 ミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11330-032
組換えヒトEGFタンパク質、CF	研究開発体制	236-EG-200	摂氏-80度で保管
CHIR99021	ケイマンケミカル	13122	摂氏-80度で保管
CHIR99021	シグマ	SML1046	摂氏-80度で保管
コラゲナーゼIV型	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17104019
ディスパーゼII	ロシュ	4942078001
抗生物質-抗真菌薬	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15240-062	光からの保護
DMEM媒体	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11965084
パラホルムアルデヒド	シグマ	P6148
アンチMCPyV LT(CM2B4)	サンタクルス	SC-136172	ロット#B2717
MCV VP1 ウサギ		ウサギポリクローナル血清 #10965	https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm