CUBICベースのタンパク質発現の可視化:全層マウス皮膚生検におけるタンパク質発現を可視化する手順

Abstract

出典:Liang, H. et al. CUBICプロトコルは、ホールマウント皮膚調製物における単一細胞分解能でのタンパク質発現を視覚化します。J. Vis. Exp (2016年)

このビデオでは、シングルセルの解像度で3Dのフルマウント皮膚生検におけるタンパク質発現を視覚的に評価するための組織クリア依存イメージング技術であるCUBICベースの可視化技術について説明しています。この技術的にシンプルなプロトコルにより、皮膚切片を調製することなく、皮膚タンパク質を可視化することができます。

Protocol

動物が関わるすべての手続きは、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 透明なマウス皮膚組織の調製

>注:この研究で使用されたすべてのマウスは、C57BL/6遺伝的背景を持っていました

1. マウスの皮膚組織のコレクション。
   1. 子宮頸部脱臼によりマウスを人道的に安楽死させます。
   2. トリマーで皮膚を傷つけないように注意しながら、関連する皮膚領域から毛を慎重に取り除きます。
   3. 皮膚を洗浄して、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の70%エタノールで除染します。
   4. 鉗子で背側の首の皮膚を持ち上げ、はさみで切開します。
   5. マウス背側の皮膚の広い領域(約1.5 x 4 cm)を解剖します。
   6. 濾紙の上で真皮を下にして皮膚を平らにし、サンプルの前後の向きをメモします。
   7. 解剖した皮膚の周りの濾紙をトリミングし、PBSで新たに調製した4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液で満たされた15mLチューブに入れます。
   8. 室温で1時間、または4°Cの冷蔵庫で一晩固定します。
   9. 15mLチューブでPBSで5分間2回皮膚を洗浄します><。

Results

図1:イメージングチャンバーの準備。A:イメージングチャンバーの調製に必要な消耗品は、ブルータック、プレイドウなど、カバースリップ2枚(24 x 50 mm)です。B:細い青鋲(直径約2mm×2cm)を2枚とカバースリップを2枚用意します。C:1枚のカバーガラスに青いタックストリップを置き、皮膚生検に十分なスペースを確保します。皮膚生検を2つのストリップの間にCUBIC2溶液の滴に入れます。D:2枚目のカバースリップを青いタックストリップに置き、皮膚生検を覆います。

....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
パラホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	P6418
エタノール 96%(変性していない)	ケミサプライ	UN1170
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPIの)	ロシュ	10236276001
N,N,N',N'-テトラキス(2-ヒドロキシプロピル)エチレンジアミン	メルクミリポア	821940
ポリエチレングリコールモノ-p-イソオクチルフェニルエーテル	メルクミリポア	648462
トリトンX-100	メルクミリポア	648462
蔗糖	シグマ・アルドリッチ	S0389
最適な切削温度 (10月)化合物	ティッシュテック	4583
抗ケラチン14抗体	コーヴァンス	PRB-155Pの
抗Ki67抗体	アブカム	AB16667
ロバ反ウサギAlexa 594	ライフテクノロジー	A21207の
ジメチルスルホキシド	シグマ・アルドリッチ	D2650
尿素	メルクミリポア	66612
2,2',2''-ニトリロトリエタノール	メルクミリポア	137002
共焦点顕微鏡	ニコンインスツルメンツ株式会社	Nikon A1 - 共焦点顕微鏡
cruZer6 フェイストリマー	ブラウン	ブラウンcruZer6フェイス
アジ化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	438456