CUBICベースのタンパク質発現の可視化:全層マウス皮膚生検におけるタンパク質発現を可視化する手順

動物が関わるすべての手続きは、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 透明なマウス皮膚組織の調製

>注:この研究で使用されたすべてのマウスは、C57BL/6遺伝的背景を持っていました

1. マウスの皮膚組織のコレクション。
   1. 子宮頸部脱臼によりマウスを人道的に安楽死させます。
   2. トリマーで皮膚を傷つけないように注意しながら、関連する皮膚領域から毛を慎重に取り除きます。
   3. 皮膚を洗浄して、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の70%エタノールで除染します。
   4. 鉗子で背側の首の皮膚を持ち上げ、はさみで切開します。
   5. マウス背側の皮膚の広い領域(約1.5 x 4 cm)を解剖します。
   6. 濾紙の上で真皮を下にして皮膚を平らにし、サンプルの前後の向きをメモします。
   7. 解剖した皮膚の周りの濾紙をトリミングし、PBSで新たに調製した4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液で満たされた15mLチューブに入れます。
   8. 室温で1時間、または4°Cの冷蔵庫で一晩固定します。
   9. 15mLチューブでPBSで5分間2回皮膚を洗浄します><。 手記：以下(1.1.10 - 1.1.12)は、組織の長期保存のためのオプションのステップです。
   室温
   10. で1時間の洗浄ステップ中に、15mLチューブ内のエタノール(25%、50%、70%)の濃度を上げてPBSで解剖した皮膚を脱水します。.
   11. 脱水した皮膚は、PBS中の70%エタノールで15 mLチューブに入れ、さらに使用するまで4°Cで保存してください。
   12. クリアの4時間前に、室温で1時間の洗浄ステップ中に、エタノール(70%、50%、25%、0%)の濃度を下げてPBSの皮膚組織を再水和します。
2. マウスの皮膚生検のクリア
   1. 3.85 gの尿素と3.85 gのN,N,N',N',N'-tetrakis(2-ヒドロキシプロピル)エチレンジアミンを5.38 mLの蒸留水に溶解し、60〜70°Cに設定したヒーターでCUBIC1清攪拌機を使用して
   調製します。
   2. 2.31 gのポリエチレングリコールモノ-p-イソオクチルフェニルエーテル/Triton X-100が透明になり、室温まで冷えたら溶液に加えます。.
   3. 鋭利なカミソリの刃でマウスの皮膚を約0.2 x 0.5 cmの生検に切り取り、15 mLチューブ内の5 mLのCUBIC1クリア溶液に浸します。毛包の視覚化を最適化するには、生検の長辺がサンプルの前後方向に沿って切断されていることを確認してください。
   4. 37°Cのハイブリダイゼーションオーブンの回転プラットフォームに置きます。
   5. 7日後に清算ソリューションを変更してください。使用前に新しいCUBIC1溶液を調製してください。
   6. 7日後に組織の透明度を確認してください。必要に応じて、組織が完全に透明になるまで、生検をCUBIC1クリア溶液に放置します。
   7. 皮膚生検が透明になったら、CUBIC1溶液を取り出し、1x PBSを4 mL加えて、組織を37°Cで6時間4回洗浄します。
   8. 皮膚組織をPBS中の20%w/vスクロースで15 mLチューブに入れ、37°Cで4時間洗浄します。
   9. 組織を封入剤で凍結します 最適切断温度 (OCT) 化合物を 15 mL チューブに入れ、-80 °C の冷凍庫で一晩<> 手記：このステップにより、その後のステップでの抗体浸透のための生検の透過性が向上します。

2. 免疫蛍光染色

1. (ステップ1.2.9)から組織を室温まで2〜3時間解凍します。
2. 15 mLチューブ内の組織を5 mLのPBSで室温で8時間洗浄し、OCTコンパウンドを除去します。
3. 生検を2 mLチューブに移し、PBST(PBS + 0.1% Triton-X100)で1:100に希釈した1 mLのウサギ抗ケラチン14抗体またはウサギ抗Ki67抗体で組織を37°Cオーブンのシェーカーで3日間インキュベー
トします。
4. 生検を15mLチューブに移し、37°Cオーブンのシェーカーで5mLのPBSTで組織を6時間4回洗浄します。
5. 生検を2 mLチューブに移し、PBSTで1:100に希釈した抗ウサギAlexa594二次抗体1 mLを加え、37°Cオーブンのシェーカーで3日間インキュベー
トします。
6. 生検を15mLチューブに移し、37°Cオーブンのシェーカーで5mLのPBSTで組織を6時間4回洗浄します。
7. 生検を2 mLチューブに移し、PBSTに1 mLの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)核対比溶液(1:1,000)を加え、37°Cオーブンのシェーカーで一晩インキュベートします。
8. DAPI対比染色液を取り出し、2 mLチューブにPBST1 mLを加えて、37°Cオーブンのシェーカーで組織を4回6時間洗浄します
   手記：オプションのステップ: 生検は、0.02% アジ化ナトリウムを含む 1x PBS で少なくとも 3 週間、暗闇で保存できます。

3. イメージング

1. 50%(w / v)スクロース、25%(w / v)尿素、10%(w / v)2,2',2'-ニトリロトリエタノール、および0.1%(v / v)Triton X-100を含むCUBIC2清澄溶液を準備します。
2. 皮膚組織を1 mLのCUBIC2溶液に2 mLチューブを入れ、シェーカーで37°Cのオーブンで24時間インキュベートします。このステップにより、組織の屈折率が均一になります。
3. ティッシュの透明度を確認してください。それが明確になったら、毛包の長さの方向がカバーガラス表面(#1 24 x 60 mm)に平行になるように、皮膚生検全体(0.2 x 0.5 cm)をガラスカバースリップ上に配置します
   手記：オプションのステップ:抗体染色生検は、CUBIC2溶液で約7日間保存できます。ナイルレッド染色生検は、CUBIC2溶液で最大1日間しか保存できないため、できるだけ早く画像化する必要があります。
4. イメージングチャンバーを準備します(図1).
   注:イメージングチャンバーの調製に必要な消耗品は、ブルータック、プレイ生地など、カバースリップ2枚(24 x 50 mm)です(図1A)。
   1. 青い鋲の細いストリップ 2 本(直径約 1 mm x 2 cm)と 2 枚のカバースリップを準備します (図 1B)。
   2. 1枚のカバースリップに青いタックストリップを置き、皮膚生検に十分なスペースを確保します(図1C、ステップ3.4.3)。
   3. カバーガラス上のストリップの間に皮膚生検をCUBIC2溶液の滴下します(図1C)。
   4. 2枚目のカバースリップで皮膚生検を覆います(図1D)。
5. 皮膚生検を取り付けたイメージングチャンバーを共焦点顕微鏡のステージに置き、組織を光経路に移動します。
6. 水銀またはハロゲン光源と標準的な落射蛍光フィルター(DAPI/GFP/CY3/CY5など)を使用してサンプルをスキャンし、蛍光染色された関心領域を同定します。
7. 10Xおよび20X対物レンズ(NA 0.75)および標準的な共焦点蛍光イメージング技術(例:DAPIで染色されたサンプルを405 nmレーザーで照射し、425〜475 nmの蛍光シグナルを収集し、Alexa Fluor 594またはNile Redで染色されたサンプルを561 nmレーザーで照射し、570〜620 nmの蛍光シグナルを収集)を使用して、関心領域を画像化します。
8. 顕微鏡のZスタック画像取得ソフトウェア(例えば、以下に説明するようにNISエレメントイメージングソフトウェア4.13を使用)を使用して、関心の各領域の画像Zスタックを生成します。
   1. 最適なレーザー出力を確保し、PMT HV/オフセット設定を選択してサンプル蛍光を収集します。
   2. 「Acquisition Controls」から「ND Acquisition」ツールバーを開きます。
   3. 「Z Series Setup」タブを選択します(他のすべてのタブが選択されていないことを確認します)。
   4. ライブスキャン中に、サンプルの上部に焦点を合わせ、「トップ」ボタンを押します。
   5. サンプルの底にフォーカスし、「Bottom」ボタンを押します。
   6. 必要なステップサイズを入力します(または最適化されたステップサイズボタンを押します)。
   7. 「今すぐ実行」ボタンを押します。
   8. 結果の Z スタックを個別の Tiff 画像スタックとして保存します (画像の Z スタックごとに 1 つの蛍光色素
   )。
9. 画像のZスタックを使用して、3D解析ソフトウェア(後述のImaris x64 7.2.3など)を使用して、関心のある3Dボリューム領域を再構築します。
   1. 解析ソフトを起動します。
   2. ツールバーの「Surpass」ボタンを選択して、3Dボリュームを生成します。
   3. 最初のカラー画像のZスタック(DAPIなど)を開きます。
   4. 「チャンネルの追加」ツールを使用して、蛍光色素ごとに1つのチャンネルであるカラーチャンネルを追加します。したがって、DAPIとAlexa Fluor 594蛍光色素の両方を含むサンプルには、2つのチャンネルが必要です。
   5. 「画像プロパティ」ツールを使用して、上記の3.7で決定された正しいピクセル(ボクセル)寸法(XYZ)を設定します。
   6. 「ディスプレイ調整」ツールを使用して、必要に応じてチャンネルの色を変更します(たとえば、DAPIチャンネルを青に、Alexa Fluor 594チャンネルを赤に設定します)。
   7. イメージウィンドウに3Dボリュームを配置するには、必要に応じてコンピューターのマウスを使用してボリュームをクリックしてドラッグします。
   8. ツールバーの「スナップショット」ツールを使用して、3D画像のスクリーンショットを生成します。
   9. ツールバーの「アニメーション」ツールを使用して、3Dサンプル回転のムービーを生成します。

図1:イメージングチャンバーの準備。A:イメージングチャンバーの調製に必要な消耗品は、ブルータック、プレイドウなど、カバースリップ2枚(24 x 50 mm)です。B:細い青鋲(直径約2mm×2cm)を2枚とカバースリップを2枚用意します。C:1枚のカバーガラスに青いタックストリップを置き、皮膚生検に十分なスペースを確保します。皮膚生検を2つのストリップの間にCUBIC2溶液の滴に入れます。D:2枚目のカバースリップを青いタックストリップに置き、皮膚生検を覆います。