初代ヒトケラチノサイトの遺伝子改変:組換えレトロウイルスを用いたケラチノサイトを遺伝子操作する方法

Abstract

出典:Li, J. et al. Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis.J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオでは、遺伝子組み換えヒトケラチノサイト組換えレトロウイルスを作製するための詳細なプロトコルについて説明しています。この方法は、ケラチノサイトにおける遺伝子発現の操作に用いることができます。

Protocol

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 遺伝子組み換え初代ヒトケラチノサイト

>注:完全なDMEM培地[DMEM + 10%ウシ胎児血清（FBS）+ペン/連鎖球菌]で増殖した両性フェニックス細胞を使用して、初代ヒトケラチノサイトに感染するウイルスを産生します。gag-polやenvelopeなどのタンパク質をコードするウイルスパッケージング遺伝子は、フェニックス細胞のゲノムに安定して組み込まれているため、レトロウイルスベクターをトランスフェクションするとウイルスが産生されます。フェニックス細胞は高効率でトランスフェクションでき、高いウイルス力価の産生が可能です。この包装ラインから産生されるウイルスは、ヒトを含む多種多様な哺乳類細胞にも感染する可能性があります。

1. 1日目:トランスフェクションの前日、完全DMEM培地中のウェルあたり800,000細胞の密度で6ウェルプレートにフェニックス細胞を播種します。
2. 2日目:トランスフェクションの日は、ウェルあたり3 μgのレトロウイルスベクターを使用します。3 μgのレトロウイルスベクターを1.5 mLチューブに分注します。ベクター3 μgごとに、100 μL DMEMと6 μLのトランスフェクション試薬を混合して使用します。1.5 mLチューブに6 μLのトランスフェクション試薬と100 μL DMEMを混合します。(使用したレトロウイルスベクターは装置・材料表に記載)
   1. 5分間インキュベートし、106 μLの混合物を3 μgのレトロウイルスベクターを含む予備分注チューブに加えます。混合し、RTで30分間インキュベートします。この混合物全体をフェニックス細胞の各ウェルに滴下します。
3. 3日目:トランスフェクションの翌日、フェニックス細胞から培地を取り出し、2 mLの新鮮な完全DMEM培地を加えます。同日、ヒト初代ケラチノサイトをウェルあたり75,000細胞の密度で6ウェルプレートに播種します。ケラチノサイトをケラチノサイト無血清培地(KCSFM)で抗生物質(ペン/連鎖球菌)とともに維持します.
   手記：初代ヒトケラチノサイトを購入しました。セルは、さまざまなベンダーから購入できます(材料テーブルに記載されています)。
4. 4日目:トランスフェクトしたフェニックス細胞から培地を採取します。フェニックス細胞にはウイルス粒子が含まれています。シリンジを使用して培地を0.45 μmフィルターに通し(汚染されたフェニックス細胞を除去するため)、2 mLをケラチノサイト(前日に75,000細胞/ウェルでプレーティング)上に置きます。臭化ヘキサジメトリン(5 μg/mL)を培地に添加して、感染プロセスを媒介します。ウイルス力価は ~1 x 10⁷ TU/mL です。
   1. 6ウェルプレートを200 x gの遠心分離機でRTで1時間回転させます。遠心後、ウイルスを含む培地を取り出し、KCSFMを添加する前に細胞を1x PBSで一度洗浄します。
5. 5日目:臭化ヘキサジメトリン(5μg/mL)を含む2mLのろ過済み培地を使用して、1.4と同じバッチのケラチノサイトに再度感染させます。200 x gで1時間RTで遠心してウイルスを含む培地を取り除き、1x PBSで洗浄してからKCSFM.
   手記：レトロウイルスベクター上に選択可能なマーカーがある場合は、薬剤を使用してケラチノサイトを選択し、ダウンストリーム分析や器官型培養などのアプリケーションで使用するために拡大します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
両親媒性フェニックス細胞株	ATCCの	CRL-3213
FUGENE 6トランスフェクション試薬	プロメガ	E2691
ケラチノサイト培地(KCSFM)	ライフテクノロジー	17005042
DMEM	ギブコ	11995
ヒト新生児ケラチノサイト	ATCCの	PCS-200-010
ヒト新生児ケラチノサイト	セルアプリケーション	102K-05N
MSCVレトロウイルスベクター	クロンテック	634401
LZRSレトロウイルスベクター	アドジーン
pSuper.Retro.Puro レトロウイルス ベクトル	オリゴエンジン	VEC-PRT-0002
臭化ヘキサジメトリン	シグマ	H9268-5Gシリーズ
FBSの	ギブコ	〒10437-028
ペン/連鎖球菌	ギブコ	15140-122