ケラチノサイトコロニー形成アッセイ:ケラチノサイトのコロニー成長能力を評価するためのIn Vitroアッセイ

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 一次ケラチノサイトの採取と播種

1. 承認された動物施設/ IACUC基準に従って、CO₂吸入により4〜5匹の成体雌マウスを安楽死させます。しかし、このプロトコルは、単一の女性/男性のマウスにも使用できます。
   1. 背側の毛皮の約9cm²を電動動物用クリッパーでクリップし、クリップしたすべてのマウスを、十分なポビドンヨード消毒液(スクラブではない)を入れた500mLの瓶に入れ、1〜2分間覆います。瓶をよく振って、消毒液をマウスに均一にコーティングします。
   2. 溶液を注ぎ、液体が透明になるまできれいな水ですすいでください。同じ消毒洗浄を繰り返してから、水ですすいでください。ヨウ素溶液で消毒洗浄した後、すべてのマウスを70%エタノールに5〜10分間浸します。
      注: 薄い毛皮を持つマウス (例: BALB/c) は、消毒剤のヨウ素洗浄によるわずかな黄色がかった色を保持しますが、暗いマウス (例: C57BL/6) は保持しません。特に、細胞の生存率や培養増殖は黄色のため影響を受けません。
2. 層流フードの親指鉗子とハサミを使用して、切り取られた背側の皮膚を慎重に取り除きます。切除した背側の皮膚をPBS / 2xゲンタマイシンで満たされた円錐形のチューブに入れます。.培養中の乳腺細胞の汚染を防ぐために、腹側皮の使用は避けてください。
3. オートクレーブ滅菌した鉗子とメスを使用して、薄いペトリ皿の上に毛むくじゃらの面を下にして、一度に1つの背側の皮膚を置きます。脂肪を含むすべての皮下組織を皮膚組織の腹側から半透明になるまで掻き取り始めます。皮膚(毛包部分)を引き裂くことなく、皮下組織の最大の痕跡を取り除くようにしてください。また、長時間こすったり、肌の乾燥を避けたりしないでください。
   1. 削った皮膚は、他のすべての残りの皮膚が処理されるまでPBS溶液に保管してください。次に、メスを使用して、皮を0.5 cm x 1〜1.5 cmのストリップにスライスし、毛むくじゃらの面を上にして滅菌済みのペトリ皿に置きます。
4. 20 mLのPBS / 2xゲンタマイシン溶液をトリプシン(0.25%)と混合して、100 mm x 20 mmのプラスチックシャーレに慎重にピペットで移します。滅菌鉗子を使用して、皮膚を移し、32°Cインキュベーターで2時間、トリプシン溶液の表面に毛むくじゃらの面を上に浮かべます。
   注:トリプシン化の時間と温度は、高度に培養可能な初代ケラチノサイトの良好な収量にとって重要です。他の方法では良好な生存細胞の収量が得られる可能性がありますが、ケラチノサイトの培養性はあまり満足のいくものではありませんでした。
   1. この2時間のインキュベーション時間中に、ディッシュをコラーゲンコーティングでコーティングし、37°Cで1時間置きます(ステップ1.1.2を参照)。クローン形成アッセイでは、60 mmのペトリ皿をケラチノサイト採取の24時間前にコーティングして、照射された3T3フィーダー層を底部に付着させ、均一に広げます。
      注: クローン培養のための培養皿のコーティングは、マウスの表皮ケラチノサイトの適切な付着、コロニー形成、および最終的な成長/増殖にとって非常に重要です。
5. 表皮掻き取りステップ:滅菌プラスチックの正方形のペトリ皿を配置し、15 mLの収穫培地で適切な表皮掻き取りのために30°の傾斜で表面を作成します(表1を参照)。湾曲した鉗子でトリプシン溶液から浮遊する皮膚ストリップを慎重に取り除きます。次に、新しいメスの刃で、表皮と毛をこすり落とします。
   1. 過度の力を加えず、表皮をこすったり、細胞の生存率に影響を与えたりするのに十分な力を加えてください。
   2. 表皮をこすり落とすときは、ブレードを皮膚片に対して垂直に保ちます。ブレードがブレードの動きに傾いていると、皮膚が破れる可能性が高くなります。ブレードがブレードの動きから離れるように角度が付けられていると、表皮の除去が不完全になる可能性が高くなります。
6. 掻き取りした表皮細胞を含む採取培地を、1.5インチの磁気攪拌バーを備えた滅菌60mLジャー(オートクレーブ可能で再利用可能)に慎重に注ぎます。ペトリ皿を追加の採取培地ですすいで、残りの表皮細胞を採取し、最終容量を30mLにします。マグネチックスターラーを使用し、室温で100rpmで20分間撹拌します。このプロセスにより、閉じ込められた表皮細胞が毛から取り除かれます。
7. 滅菌済みの70 μmセルストレーナーを50 mLコニカルチューブの上部に置きます。セルストレーナーは、50mLのコニカルチューブの上に収まります。
   1. 瓶をバイオセーフティフードの中に入れます。攪拌子を取り外し、内容物を50mLのコニカルチューブに取り付けられたストレーナフィルターに注ぎます。不要な髪と角質層のシートを濾します。
   2. ストレーナー内の角質層の材料と一緒に毛を押し、それらを操作して閉じ込められた有毛細胞を解放します。5 mLの回収培地を使用して、残りのトラップ細胞が放出され、チューブに流れ込むのを待ちます。円錐形のチューブで総容量を最大50mLにします。
8. 50 mLのコニカルチューブに細胞濾液を充填し、160 x gで4°Cで7分間遠心分離します。次に、上清を吸引し、5mLの収穫培地を追加します。最後に、5 mLピペットで~20回穏やかにトリチュレートすることにより、細胞ペレットを再懸濁します。
   1. このステップでは、凝集を避けるためにセルをアイスボックスに入れておきます。次に、25mLの収穫培地を加え、再度回転させます(20〜25倍)。
   2. このステップで正確なケラチノサイト数を確保するには、1 mLの細胞懸濁液を採取し、19 mLのハーベスティング培地を加えます。現在、細胞希釈は50mLのコニカルチューブで1:20です。ケラチノサイトを1匹のマウスから採取する場合は、細胞懸濁液の量を調整します。例えば、30mLの代わりに15mLを使用し、細胞をカウントするために1:10の希釈を行います。
9. 希釈した細胞0.5 mLを50 mLコニカルチューブ(1:20希釈)からピペットで移し、1.5 mLのオートクレーブ滅菌済みマイクロ遠心チューブに移します。0.2 mL(200 μL)の細胞ミックスを別の1.5 mLの微量遠心チューブに移し、等量(200 μL)の0.4%トリパンブルー溶液を加えます。この溶液を3回穏やかに混合し、細胞を血球計算盤に移して有核ケラチノサイトをカウントします。
   1. トリパンブルー陽性のすべての濃青色の細胞を生存不能な死細胞として採点し、小さな金色とピンクがかった細胞を生存細胞として採点します。したがって、マウスあたりの最終的なケラチノサイト収量は、約3,000万個の生存細胞になるはずです。
10. 元の50 mLコニカルチューブ(ステップ1.8)を160 x g、4°Cで7分間遠心分離します。このステップでは、細胞を目的の培地に再懸濁し、細胞の播種に必要な希釈を行います。
    1. 大量培養の場合は、細胞培養培地(KGM型培地+単層培養用サプリメント)の35 mmシャーレごとに2〜400万個の生存金細胞を播種します(表1を参照)。クローン形成(コロニー形成)アッセイでは、X線照射したスイスマウス3T3フィーダー層に60 mmペトリ皿あたり1,000個の細胞を播種し、コラーゲンコーティングを施し、改良したWillia's E培地にサプリメントと血清を添加します。
    2. 35mmと60mmのシャーレにそれぞれ合計2〜4mLの培地を使用してください。また、ATCCから調達したDMEMおよびWilliams E培地を、重炭酸ナトリウムのレベルを減らして5%CO₂で使用するように配合します。
11. 培養細胞(質量またはクローン生成)を32°C、湿度95%、5%CO₂で増殖させます。初回播種から1日後に培地を交換して大量培養を行い、その後は週3回交換します。ただし、クローンアッセイの場合、最初の培地交換は細胞播種後2日で、その後は週3回です。
12. クローン培養の場合は、2週間間隔と4週間間隔で細胞を培養します。クローン培養の完了後(2〜4週間)、培地を吸引します。コロニーを10%緩衝ホルマリンで室温で一晩固定し、0.5%ローダミンBをオートクレーブ水で1時間染色します。次に、皿の端からピペットでローダミンBの汚れを取り除きます。
    1. 冷たいオートクレーブ水で皿が透明になるまですすぎます。皿を傾けて皿の蓋に置き、最終的なコロニーカウントのために乾かします。特に、クローン原性培養アッセイを行う際には、<1 mLの細胞をピペットしないでください。細胞が濃縮されている場合は、細胞濃度を順次希釈します。

表1:溶液と培地のレシピ。