miniCoopRベクターベーストランスジェネシス:ゼブラフィッシュ腫瘍モデルにおける黒色腫誘導遺伝子をスクリーニングする技術

動物が関わるすべての手続きは、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 黒色腫発症修飾因子のスクリーニング

1. PCRによりGatewayミドルエントリークローンを作成し、目的遺伝子(GOI)の全長オープンリーディングフレームを増幅し、BPクローナーゼII(Invitrogen)を使用してpDONR 221に再結合します。Multisite Gatewayテクノロジー(Invitrogen)を使用して、p5E_mitfa、pME_GOI、Tol2kit #302 p3E_SV40polyA、およびminiCoopRを再結合し、miniCoopRベクターのmitfaプロモーターの下に目的の遺伝子を配置します(図1A)。
2. 各クローンの25ピコグラムと25ピコグラムのTol2トランスポゼースmRNAを1細胞Tg(mitfa:BRAFV600E)に注入します。p53(LF);mitfa(lf)前述の通りの三重ホモ接合ゼブラフィッシュ胚。注入した胚を28.5°Cでインキュベートし、死んだ胚を24 hpfで取り除きます。
3. 72 hpfで救助されたメラノサイトを持つトランスジェニック動物を選択するには、注入された胚を含むペトリ皿を白い背景に対する入射光の下で解剖顕微鏡に置きます(図1A)。
4. ゼブラフィッシュ施設の苗床にある3つのLタンクに動物を4dpfで移します。
5. 2か月後、メラノサイトのレスキューの少なくとも1つの領域が4 mm²を超える動物を選択します(図1A)。72 hpfでのメラノサイトレスキューの程度と2か月でのメラノサイトレスキューの程度との間には強い相関関係があります。メラノサイトレスキューの胚を72 hpfで選別すると、その大多数(~80%)は、2か月で少なくとも1つのメラノサイトレスキュー領域が4 mm²を超えます。
6. 選択した動物に腫瘍の存在がないか毎週スクリーニングします(図1B)。病理組織学的変化と形態学的変化との間には強い相関関係があります。良性から悪性への移行は、病変が動物の表面から浮き上がるときの形態学的変化として認識されます。研究のために腫瘍発生動物を分離します。
7. 横軸の週単位の年齢と縦軸の黒色腫のない生存率の黒色腫のない生存曲線を描きます。目的遺伝子を発現するメラノサイトを持つ動物を、メラノサイトにEGFP(増強緑色蛍光タンパク質)を発現する対照動物と比較します(図1C)。miniCoopR-EGFPを注射された動物の腫瘍発症の中央値は約18週です。2つの曲線が統計的に異なるかどうかを、対数順位検定を使用して判断します。

図 1.miniCoopRアッセイを用いたメラノーマ発症修飾因子のスクリーニング。A) miniCoopRアッセイの概略図。miniCoopRベクターと目的の遺伝子を含むレスキューされたメラノサイト(矢印)を持つ胚。スケールバー = 250 μM. 4 mm2 を超えるメラノサイトレスキュー (矢印) を持つ成人。スケールバー = 500 μM B) MiniCoopR-EGFP は、アメラノーシスと色素性腫瘍 (矢じり) でゼブラフィッシュを救助しました。C) がん遺伝子SETDB1を発現する腫瘍と対照EGFP遺伝子(p = 9.4×10-7、log-rankχ2)を比較した代表的な黒色腫無生存曲線。