スケールメラノサイトの抗体染色:ゼブラフィッシュモデル背側スケール関連メラノサイトに発現する転写因子を検出する技術

要約

出典:Sharanya Iyengar et al. ゼブラフィッシュ自生腫瘍モデルを使用したメラノーマ修飾因子のスクリーニング。 J. Vis. Exp. (2012年)

この動画では、ゼブラフィッシュモデルの背側鱗関連メラノサイトにおける転写因子の発現を検出するための抗体染色法について説明しています。この免疫染色技術は、トランスジェニックゼブラフィッシュのメラノサイト誘導トランスフェクション因子-Aを特異的に同定するのに役立ちます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. スケールメラノサイトの抗体染色

1. 80 mL 0.1M Na₂HPO₄ および 20 mL 0.1M NaH₂PO₄ で PO₄ バッファーを調製します。pHが7.3であることを確認してください。8.0 g のスクロース、0.15 mL 0.2M CaCl₂、および 90 mL の 0.2M PO₄ バッファー (pH 7.3) を含む 2x 固定バッファーを調製します。必要に応じて、NaOHまたはHClでpHを7.3に調整し、PO₄バッファーで最大100mlにします。
2. 最大 300 mg の固体 PFA を秤量し、微量遠心チューブに加えます。PFA の 4.5 x 質量 (mg 単位) に等しい容量に 5 mM NaOH を添加します (例: 450 ul 5 mM NaOH を 100 mg PFA)。PFAが溶解するまで時々振とうしながら、60〜70°Cで加熱します。残った微粒子をスピンダウンし、20%PFA上清を回収します。毎回新鮮にしてください。
3. 1x fix bufferと4% PFAを含む固定液を調製します。
4. 魚を0.17 mg / mLトリカインで麻酔します。.
5. 解剖顕微鏡で入射光を使用して、鋭利な先端の細い鉗子を使用して背側の鱗を摘み取り、メラノサイトを含む鱗の半分を傷つけないように注意します(図1A)。スケールを鉗子から直接1 mLの固定溶液に入れ、回転させながら室温で≥2時間インキュベートします。魚を魚の水に移し、魚を監視して回復が成功したことを確認します。
6. 色素性メラノサイトを漂白するには、PBST(1x PBS pH 7.4、0.1% Triton X-100)で固定スケールを室温で5分間2回洗浄します。5mLに0.4mLの10%KOHと0.15mLの30%_H2O2を含む作りたての漂白剤溶液1mlをdH ₂Oで加えます。顔料がなくなるまで漂白を続けます(通常は10分)(図1B、C)。PBSTで室温で5分間4回洗浄します。
7. 1x PBS pH 7.4、0.2% Triton X-100、2 mg/mL BSA、1% DMSO、0.02% NaN₃、および 2% ラム血清からなるブロック溶液で少なくとも 30 分間ブロックします。HRP反応で発生する場合は、NaN₃を省略します。
8. 一次抗体とブロック溶液中で室温で一晩インキュベートします。サンプルを水没させておくには、サンプルの上に少なくとも400μLの溶液が必要です。
9. スケールをPBSTで室温で30分間3回洗浄します。
10. 二次抗体と2時間から一晩、室温のブロック溶液でインキュベートします。
11. PBST + 0.1 μM DAPIで10分間染色します。
12. PBSTで5分間3回洗浄します。
13. スケールをスライドガラスに取り付けて、ベクタシールドのドロップにスケールを取り付けて、スケールの凹面がスライドに向かって下を向くようにし、ガラスカバースリップをその上に置きます。スライドの端を透明なマニキュアで密封し、蛍光顕微鏡でスライドを観察します(図1D、E、F、G)。

結果

図 1.スケールメラノサイトの抗体染色。 A) 麻酔をかけた miniCoopR-EGFP ゼブラフィッシュから鱗を摘み取る様子。B)色素沈着メラノサイトを含む無漂白スケール、およびC)miniCoopR-EGFPゼブラフィッシュの漂白スケール。スケールバー = 100 μM. D) Mitfa抗体およびE) DAPIで染色した未漂白スケール。漂白スケールをF)Mitfa抗体およびG)DAPIで染色。スケールバー = 40 μM。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ゲートウェイ組換え試薬	インビトゲン
ミニクープR
Mitfa抗体
FITCヤギ抗ウサギIgG抗体	インビトゲン
ベクタシールド	ベクターラボ	H-1000
キャスパーゼブラフィッシュ
701N 10 μL シリンジ	ハミルトン/フィッシャー	14〜824
FBSの	インビトゲン	26140079