皮下移植アッセイ:ドナーからレシピエントゼブラフィッシュモデルへのメラノーマ細胞移植法

要約

出典:Iyengar, S. et al. ゼブラフィッシュ自生腫瘍モデルを用いたメラノーマ修飾因子のスクリーニング。J. Vis. Exp.(2012年)

このビデオでは、メラノーマを持つドナーゼブラフィッシュモデルから免疫不全のレシピエントであるキャスパーゼブラフィッシュに腫瘍細胞を移植する方法について説明しています。これは、レシピエント魚の腫瘍の生着と増殖を視覚化するのに役立ちます。

プロトコル

動物が関わるすべての手続きは、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 移植アッセイ

1. 移植の1日前に25Gyのガンマ線を照射することにより、生後2〜3か月のキャスパーフィッシュを準備します。魚が魚の水で回復するのを待ちます。
2. 機関のガイドラインに従って、腫瘍を持つ魚を安楽死させます。具体的には、魚を0.6 mg / mLトリカインの入った皿に、鰓の動きが止まるまで入れます。
3. 腫瘍を切り取り、5%FBSで0.9x PBSを滅菌した約5mLフィルターを入れたシャーレに入れます。溶液中に腫瘍をかみそりでさいの目に切ります。
4. 室温で作業し、P1000ピペットで粉砕して単一細胞を取得します。フィルター滅菌した0.9x PBSと5%FBSで容量を25mLにします。
5. 40 μMメッシュフィルターでろ過します。
6. Eppendorf 5810R卓上遠心分離機で1,500rpm(453 rcf)で10分間回転します。
7. 上清を取り除き、細胞懸濁液をほぼ所望の濃度にします(100 mm³の腫瘍に対して10⁷細胞を想定します)。
8. 血球計算盤を使用して正確な細胞数を計算し、最終注入量が約5μLになるように細胞懸濁液を希釈します。例えば、50,000個の細胞を注入する場合、細胞懸濁液を最終濃度10,000細胞/μLまで希釈し、細胞の凝集を防ぐために細胞懸濁液の入ったチューブを数分おきにフリックします。
9. 26sゲージ(ベベルチップ)701 N 10 μLハミルトンシリンジを100%エタノールと0.9x PBSで2〜3回洗浄します。シリンジに5μLの細胞懸濁液をロードします。
10. 照射されたレシピエント魚を0.17 mg / mLトリカインで麻酔します。.広告の上に魚を横向きに置きますamp キムワイプ(図1A)。
11. 片手で魚を安定させ、斜角を上にして針を腹腔の上の魚の側面に45°の角度で挿入します。後脳の後方境界と背びれの前境界の約中間あたりで、プランジャーを静かに押し下げます(図1B)。
12. 魚が新鮮な魚の水で回復するのを待ち、腫瘍の生着について毎日魚を観察します(図1C)。生着が起こった場合、継続的な成長と病気の発症も観察できます。

結果

図 1.黒色腫細胞の移植。A)未注入のキャスパーゼブラフィッシュ。スケールバー= 500μM.B)50,000個の黒色腫細胞を注射した直後の照射されたCasperレシピエントの皮下移植部位(矢印)。スケールバー = 200 μM) 注射の 2 週間後に腫瘍の生着を示す Casper レシピエント (矢印) に 50,000 個の黒色腫細胞を照射しました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ゲートウェイ組換え試薬	インビトゲン
ミニクープR
キャスパーゼブラフィッシュ
701N 10 μL シリンジ	ハミルトン/フィッシャー	14〜824
40 μMフィルター	BDファルコン/フィッシャー	352340
FBSの	インビトゲン	26140079