腫瘍細胞浸潤アッセイ:上皮間葉系細胞の相互作用を評価するための3D In Vitroネイティブマトリックスベースの方法

要約

出典:Ng, Y. Z. et al. Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion.J. Vis. Exp.(2014年)

このビデオでは、腫瘍細胞の浸潤を研究するためにネイティブマトリックスを利用する技術について説明しています。このアッセイで使用される技術は、合成マトリックスや外来マトリックスを必要とせずに、3D設定で上皮-間葉系細胞の相互作用を評価する能力を提供します。

プロトコル

1. 培地と試薬の調製

1. 200xのL-アスコルビン酸2-リン酸ストックの調製
   1. ダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM)溶液5 mLあたり29 mgのL-アスコルビン酸2-リン酸を溶解し、0.22 μmメンブレンフィルターでろ過します。0.25 mL滅菌アリコートとして-20°Cで保存してください。
   2. 必要な日に、線維芽細胞培地(1% L-グルタミンと10%ウシ胎児血清を含むDMEM)50 mLごとに200x L-アスコルビン酸2-リン酸ストック0.25 mLを添加し、最終濃度0.1 mMのL-アスコルビン酸2-リン酸
   を添加します。
2. ケラチノサイト増殖培地の調製
   1. 原発性扁平上皮がん(SCC)ケラチノサイトの単離と培養は、以前に説明されています。ケラチノサイト増殖培地の調製も、その中に記載されている。
   2. 簡単に言うと、メディアを次のように準備します:
      300 mL の DMEM と 100 mL の Ham's F-12 に 10% FBS
      を添加 0.4 mg / mLヒドロコルチゾン
      5 mg/mL インスリン
      10 ng/mL EGF
      5 mg / mLトランスフェリン
      8.4 ng/mL コレラ毒素
      13 ng/mL リオチロニン
      1x ペニシリン-ストレプトマイシン溶液

2. L-アスコルビン酸2-リン酸添加培地における線維芽細胞由来天然マトリックスのin vitro構築

1. L-アスコルビン酸2-リン酸を添加した線維芽細胞培地中の6ウェルプレート(20,000細胞/cm²)にウェルあたり200,000個の線維芽細胞を播種します。2〜3日ごとに2〜5mLの培地を再給餌します。(注:再供給の頻度と量は、異なる細胞の個々のニーズに合わせて調整される場合があります。
2. 細胞外マトリックスに埋め込まれた細胞の厚い層は、肉眼で見える6週間の終わりに形成されます(図1)。この層を組織培養プレートから放出するには、1 mLのマイクロピペットチップでマトリックスの周囲を静かにこすり、マトリックスの端をウェルの中心に向かって押します。この細胞とマトリックスの層(ネイティブマトリックス)は、プレート表面から簡単に取り外すことができ、メディアに浮遊している必要があります。ネイティブマトリックスをメディアに広げて、それ自体が折りたたまれないようにします。
3. ネイティブマトリックスをフロートさせて5日間再モデル化し、2〜3日ごとにメディアを交換します。マトリックス内の引張強度と固有のリモデリングにより、マトリックスは大幅に収縮し、より小さく、しかしより厚いネイティブマトリックスに縮小され、侵入アッセイに利用する準備が整います。

3. 腫瘍SCCケラチノサイトによる浸潤アッセイ

1. 鈍い鉗子でネイティブマトリックスを優しく拾い上げ、ナイロンネットに移します。ナイロンネットに乗せたら、1 mLのマイクロピペットチップと鈍い鉗子を使用して、マトリックスをできるだけ平らになるように穏やかに広げます。
2. 滅菌クローンシリンダーの片方の端に少量の滅菌ワセリンを塗抹して、滅菌クローンシリンダーを準備します。
3. クローン円柱をネイティブマトリックスに置き、ワセリン側を下にして置きます。これは、ネイティブマトリックスとクローンリングとの間の密閉性を確保するためです。
4. cSCC細胞をクローンシリンダーに添加します(ケラチノサイト増殖培地100μlに250,000細胞)。
5. cSCC細胞がネイティブマトリックスに落ち着いた6時間後にクローンシリンダーを取り外してください。
6. ネイティブマトリックスとcSCCセルを備えたナイロンネットを、曲げたステンレス鋼の金網サポート上の空気と液体の界面に持ち上げます。
7. アスコルビン酸を添加したケラチノサイト増殖培地を、培地レベルがネイティブマトリックスの底部に接触するまで加えます。
8. 2〜3日ごとに培地を交換し、cSCC細胞の播種後、7日と14日で収穫します。

結果

図1.線維芽細胞由来のネイティブマトリックスの生成と腫瘍浸潤アッセイのワークフロー。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
L-アスコルビン酸 2-リン酸	シグマ	A8960
L-グルタミン、4,500 mg/L D-グルコース、110 mg/L ピルビン酸ナトリウムを含む DMEM	ライフテクノロジー	11995年073
100x ペニシリン-ストレプトマイシン	ライフテクノロジー	15070
ワセリン	VWRの	PROL28908.290
クローンシリンダー	シグマ	Z370789
ナイロンネットフィルターディスク親水性100μm、25μm直径100個入り	ミリポア	NY1H02500
曲がったステンレス鋼の金網サポート	自社製		メッシュが6ウェルプレートに収まるように寸法を記入しました