間伐-頭蓋骨の準備を使用してマウス視覚野の慢性的イメージング

Summary

このビデオと補足資料では、我々は慢性のプロトコルを示す in vivoでイメージング。

Abstract

二光子レーザー走査顕微鏡（2PLSM）を用いた in vivoイメージングでは無傷の脳で生きている細胞と神経突起の研究ができます。ここで紹介するテクニックは、中枢神経系におけるシナプス後興奮部位の大部分を表す小さな構造である樹状突起の追跡を可能にする顕微鏡の分解能を持ついくつかの時点（慢性の画像）で脳の同じ領域のイメージングを可能にします。明らかにいくつかの時点では問題なく皮質の構造を解決するためには、シナプスと回路のリモデリングにおける形態学的変化は、根本的なメカニズムを説明することがする脳の可塑性の研究では特に、多くの利点があります。このビデオと補助材料では、我々は、間伐、頭蓋骨の準備を使用して無傷の脳のin vivoイメージング慢性ためのプロトコルを示す。間伐-頭蓋骨の準備は、このように炎症反応の発症を減らすこと、硬膜および/または皮質が損傷する可能性を回避する低侵襲アプローチ、である。このプロトコルが正しく実行されると、それは明らかに長期間にわたって無傷の脳内の樹状突起棘の特性の変化を監視することが可能です。

Protocol

1. 二光子顕微鏡、ニューロンが蛍光マーカーで標識されている準備を使用して無傷の脳内の神経細胞を可視化するために使用されます。実験で我々は層5錐体細胞には^{1をラベルする} GFP - Mトランスジェニックマウスのラインを使用するここで紹介。層5錐体細胞は、PIAのレベル以下に300μmの深さに樹状突起と樹状突起棘の可視化を可能に、浅層に樹状突起を投影。代替アプローチは、ウイルスマーカーを用いて細胞を（ らロウェリーを参照してください。、Joveのために提出された）ラベルを付けることです。
2. 無菌手術のために70％エタノールおよびオートクレーブのツールを使用してワークスペースを滅菌する。きれいなドレッシングを使用してオペレーティング表面を覆う。
3. IACUC承認された手順を使用してAVERTINの四半期投与量（0.0075 mg / ml）を、続いフェンタニルカクテル（metatomadinは0.5 mg / kg体重;ミダゾラム5 mg / kgのフェンタニル0.05 mg / kg体重）をマウスに麻酔。鎮痛剤をマウスに前処理、ブプレノルフィン（0.5 mg / kg）を（SQ）皮下投与。テール/つま先ピンチに反応をテストすることによって、麻酔薬平面のレベルを監視します。
4. 37.5で動物を維持° C添付の直腸温度計で加熱毛布を用いた。
5. 乾燥から目を防ぐために、眼に眼軟膏を適用します。手術中に、光源から目を保護するために紙の小さなシートとフードの目。
....

Discussion

二光子顕微鏡を用いて慢性的なイメージングは、可塑性^2-5時にトリガーの形態学的変化を研究するためにますます一般的な手法になりつつあります。ここでは、異なる画像間で無傷のマウス脳内の識別された樹状突起に従うことを間伐-頭蓋骨の準備を示しています。このプロトコルでは、頭蓋骨は皮質への最小限の損傷を引き起こし、脳の機能^6を変える可能性の神経炎症の非常に低いレベルで、その結果、そのまま残されます。これは、動物はすぐに最初の手術後にしてから数年後に続いてイメージを再作成日イメージングすることができます。これは強力なテクニックですが、にも限界があります。頭蓋ウィンドウがクリアされている間に開頭し、そ​​れゆえ関連するグリアの活性化を伴う、より侵襲的なウィンドウの準備は、イメージングのセッションの任意の数と脳の繰り返しイメージングすることができます。薄い頭蓋骨の準備は、しかし、マウスの皮膚を開閉に関わる手術のために最大で3つの画像のセッションに制限されています。さらに、深さの浸透は、頭蓋ウィンドウ²に優れています。慢性的なイメージング実験のための外科的アプローチを決定する際には慎重に検.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
タニルクエン酸		インハウス		フェンタニルカクテル:麻酔カクテル; IP 用量: 0.0125 ml/g Final カクテル濃度: 0.05 mg/kg
メデトミンジン塩酸塩		インハウス		フェンタニル カクテル: 麻酔カクテル; IP 用量: 0.0125 ml/g Final カクテル濃度: 0.05 mg/kg
ミダゾラム HCL		インハウス		フェンタニル カクテル: 麻酔カクテル; IP用量:0.0125 ml / g / g < br / > 最終カクテル濃度:0.05 mg / kg
2,2,2-トリブロム–タノール				アヴェルティンカクテル:麻酔薬; IP用量:0.0075 cc / g 最終カクテル濃度:1%
2-メチル-2-ブタノール(最終濃度:0.775%)				アベルチンカクテル:麻酔薬; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775%
TC-1000 温度制御システム		CWE, Inc.	TC-1000マウス	の体温度調節
Toberadex		In House		Eye Ointment
10%塩化第二鉄		Ricca Chemical Company	3120-32	Thin-skull preparation
Microsurgical Blade		Sable Industries	S-6400	Thin-skull preparation
シアノアクリレート 404,401		Loctite	P/N 46551	薄い頭蓋骨の準備
シアノアクリレート 401		ロックタイト	P/N 40140	薄い頭蓋骨の準備
ジップキッカー グルー アクセラレータ		ペーサー技術	PT-29	薄い頭蓋骨の準備
マイクロドリル スチールバリ 0.7mm 先端径		ファインサイエンスツール	19008-07	薄い頭蓋骨の準備
Microtorque コントロールボックスと Tech2000 ハンドピース		ラムプロダクツ株式会社	TECH2000ON/OFF	薄髏製剤
#6-0 (0.7メートル) シルク縫合		エチコン	K8894H	テーパー C-1
アイドレッシング鉗子、10cm、先端幅 0.5mm、湾曲	した手術器具	ファイン サイエンス ツール	11152-10
エクストラ ファイン ボン ハサミ、8.5cm、ストレート チップ、刃先 13mm	手術器具	ファイン サイエンス ツール	14084-08
標準パターン鉗子、ストレート、2.5mmx1.35mmtip、12cm	手術器具	ファイン サイエンス ツール	11000-12