間伐-頭蓋骨の準備を使用してマウス視覚野の慢性的イメージング

1. 二光子顕微鏡、ニューロンが蛍光マーカーで標識されている準備を使用して無傷の脳内の神経細胞を可視化するために使用されます。実験で我々は層5錐体細胞には^{1をラベルする} GFP - Mトランスジェニックマウスのラインを使用するここで紹介。層5錐体細胞は、PIAのレベル以下に300μmの深さに樹状突起と樹状突起棘の可視化を可能に、浅層に樹状突起を投影。代替アプローチは、ウイルスマーカーを用いて細胞を（ らロウェリーを参照してください。、Joveのために提出された）ラベルを付けることです。
2. 無菌手術のために70％エタノールおよびオートクレーブのツールを使用してワークスペースを滅菌する。きれいなドレッシングを使用してオペレーティング表面を覆う。
3. IACUC承認された手順を使用してAVERTINの四半期投与量（0.0075 mg / ml）を、続いフェンタニルカクテル（metatomadinは0.5 mg / kg体重;ミダゾラム5 mg / kgのフェンタニル0.05 mg / kg体重）をマウスに麻酔。鎮痛剤をマウスに前処理、ブプレノルフィン（0.5 mg / kg）を（SQ）皮下投与。テール/つま先ピンチに反応をテストすることによって、麻酔薬平面のレベルを監視します。
4. 37.5で動物を維持° C添付の直腸温度計で加熱毛布を用いた。
5. 乾燥から目を防ぐために、眼に眼軟膏を適用します。手術中に、光源から目を保護するために紙の小さなシートとフードの目。
6. はさみを使って、目に頭の後ろ（耳の後ろ）から髪を削除する。
7. 70％エタノールのシーケンシャルアプリケーションと動物の頭の上をきれいに、betadineスクラブとbetadineの溶液を加えた。
8. 眼への正中線（イメージ化される半球に応じて）の右側または左側に沿って耳と、最大の後ろにL -カットの切開を行います。手術部位から皮膚を倍以上との距離。皮膚がイメージングセッションは、次縫合されるため、皮膚を削除しないでください。
9. 微細な鉗子を使用すると、静かに関心のある分野から持ち上げ、皮膚を引っ張る。
10. 優しく清潔なピンセットや顕微ブレードと頭蓋骨の露出面積から骨膜を削り取る。綿棒を使用して、完全に骨膜メンブレンを乾燥させると、それは完全に削除されていることを保証するために頭蓋骨に10％塩化第二鉄を少量。頭蓋骨は（11を参照）接着剤の適切な付着を確保するために、完全に乾燥していることが重要です。鉗子または顕微ブレードを使用して、静かに乾燥させ骨膜の膜をこすり落とす。
11. ステンレス鋼のヘッドプレート（図1を参照）し、印を押さなけれ頭蓋骨にプレートのイメージングのウィンドウ周りシアノアクリレート接着剤の薄層を適用します。
12. 綿綿棒の棒の木の端を使用して、画像ウィンドウの内側の縫い目に接着剤を適用し、イメージングプレートと頭蓋骨の曲率の間のすべてのギャップを埋めることを確認すること。
13. ウィンドウに接着剤のアクセラレータのドロップを置きます。すぐにワイプ綿棒または金と過剰な接着剤のアクセラレータを拭き取る。接着剤は完全に掘削する前に固化してください。
14. 0.7ミリメートルのステンレス鋼ばりを貼付歯科用ドリルを用いた撮像ウィンドウで頭蓋骨を薄くし始める。 0.9％滅菌生理食塩水の臨時のアプリケーションで代替掘削は頭蓋骨上にあまりにも多くの熱を生成しないように。
15. 歯科用ドリルで頭蓋骨の表面全体に小さなストロークを使用して頭蓋骨上に薄いの4x4 mmのウィンドウ。平滑末端の鉗子で頭蓋骨の薄さをテストします。頭蓋骨の表面は穏やかな圧力をわずかにインデントされます。イメージングに最適な頭蓋骨の厚さは10〜30μmである。
16. 頭蓋骨が薄いと、すべての破片を掃除窓の場合は、頭蓋骨に生理食塩水を置きます。解剖スコープに取り付けられたデジタルカメラとイメージングのウィンドウを撮影。脳血管系の写真と使用は、その後のイメージングセッションのためにイメージングプレートを配置する位置を見つけるのに役立ちます。
17. 2光子リグに動物を輸送しています。動物全体のイメージングセッション中に加熱毛布（直腸プローブ付き）にままにしてください。注：鎮静下にある間、動物の体温は、皮質損傷または場合によっては死に至る加熱装置のない状態で大きく変動します。
18. マイタイレーザー、最大電力および変更されたオリンパスFluoview共焦点ユニット用10Wソリッドステートポンプを使用した2光子顕微鏡が使用されます。システムは、脳からの蛍光の最大の検出を可能にするために可能な限り客観的に近いとしてインストールされている深部組織のイメージングと外部検出器に最適化されています。オリンパスLUMPlan FL / IR 20X/0.95NAの対物レンズが使用されます。 0.9％生理食塩水は、客観的な浸水のための画像処理時に使用されます。
19. 明るく標識したニューロンを含む領域を識別するこの顕微鏡を使用して、低デジタルズーム（× 1）。
20. 顕微鏡の接眼部に固定されたデジタルカメラを使用して、撮像領域の写真を撮る。また、血液の血管パターンの概略を述べる。これは、再することが必要ですその後の時点で同一の撮像位置に回します。
21. 樹枝状分岐の程度を示す脳の全体の可視範囲（通常は〜200μmをスパニング）を介して、低倍率のスタック（5μmのステップX20の目標、512 × 512ピクセル）を取得。注：この低倍率の画像は、血管や樹状突起の両方が若く、成熟した動物で、その構造を維持するとして、その後の時点でのイメージング領域を見つけるために使用されます。
22. イメージングソフトウェア（Fluoview、V. 5.0、FV300）を使用して、8倍デジタル倍率を増加させる。 X、Y座標（パン座標）を必要に応じて調整し、場所と樹状突起棘の構造を含む、詳細な樹枝状形態が表示されます高倍率のスタックを収集する。各スタックコレクション、すなわちパン座標、コレクション、Z -ステップサイズおよびスタック内のステップ数の範囲についての詳細なメモを取る。その後の時点で、この樹状突起や軸索に戻るときにこれらのノートは使用されます。
23. イメージングの後、静かに頭蓋骨の表面から板を分離することにより、ヘッドプレートを取り外します。鉗子を使用して、頭蓋骨に残った残留接着剤を除去し、0.9％滅菌生理食塩水で頭蓋骨の表面を拭いてください。 ＃6の縫合糸を使用して一緒に頭蓋骨を介して皮膚を縫合。 70％エタノールでエリアを拭いてください。手術後の回復中に痛みを軽減するために、0.1 mg / kgのブプレノルフィンの鎮痛、SQを管理する。
24. それが起動して、モバイルになるまで加熱ランプの下できれいなケージで動物を置きます。オリジナルのケージに動物を返します。
25. 後の時点でのイメージを再作成の動物（私たちの撮影時間のポイントが離れて2日から何ヶ月にどこでも構いません）に、ステッチを削除するか、上記のような無菌の方法を使って頭の上に皮膚を再び開きます。元画像の場所を見つけるために脳血管系（最初の手術の日に撮影）のデジタル画像を使用してください。 Reaffixステンレス鋼headplate（ステップ10-12）。撮影時間の点の間に再成長している可能性のある骨離れて静かに薄いために顕微ブレードを使用してください。歯科用ドリルで薄い、必要に応じて。明確なイメージング破片のウィンドウと0.9％滅菌生理食塩水の滴を適用する。
26. 二光子顕微鏡に動物を運ぶと、元画像のフィールドを探します。援助のための最初のイメージングセッション中に撮影されたデジタル写真を使用してください。
27. Fluoviewプログラムを開き、元の低倍率の画像を開きます。貼って、コンピュータの画面に透明シートや透明性のペンを使用して主要な血管のパターンをスケッチ。
28. ライブ画像を開いて、透明フィルム上にスケッチパターンへの血液の血管系を再調整してください。
29. 構造にズームイン8倍速のイメージを再作成するには、以前のイメージングセッションから目的収集したスタックを開く。コンピュータの画面に貼付透明フィルム上に構造を（グリア、樹状突起、軸索すなわち）、スケッチ。
30. ライブイメージから8倍速でのズームとパンを設定するには、初日のイメージングパラメータに変換します。低倍率の位置を揃えるの精度に応じて、それはまた、若干画像の角度を調整する必要があります。所望の構造が発見されると、あなたのスケッチ高倍率のパターンに構造を一致させる。その後の分析のためのZスタック画像の同一のステップの大きさと数でz -スタックを収集する。
31. すべての高倍率の画像が再収集されるまで、手順29と30を繰り返します。
32. イメージングが完了したら、手順22から24を繰り返します。再イメージングは​​、2つの独立した時点にでまで繰り返すことができる。
33. 動物実験は、実験動物のケアの評価と認定のために協会が完全な認定で、医学と歯学のロチェスター大学大学の実験動物医学のビバリウムと部門が定めたガイドラインと規則に従って行われた州法、連邦法及びNIHのポリシーに準拠して国際的な（AAALAC）となります。

代表的な結果

GFP - M発現マウスでは、層5錐体細胞とそれに対応する樹状突起のサブセットは容易に2光子レーザー走査顕微鏡^{（2PLSM）1を}用いて可視化することができます。ここでは、目的の画像の位置上の頭蓋骨が〜10から30ミクロンまで薄くされている間伐-頭蓋骨の準備を示した。正しく実行される、我々のプロトコルは、私たちは明らかに急性または慢性の分析（図2）のための完全な視覚野における皮質の樹状突起と棘を可視化することができました。

図1。カスタムヘッドとベースプレート。間伐-頭蓋骨の手術の準備のために使用されるカスタムメイドのヘッドとベース板の（）上から見た図。カスタムメイドの頭部と底板の（B）は側面図。 （C、D）ヘッドプレートの詳細な回路図と画像。

in vivoで画像化樹状突起。画像は175μmの最終的な深さにPIAからすべての5μmを得られる単一のイメージの投影です。の箱入りのエリアは、（B）と（C）0日目に結像（D0）と4日後（D4）の拡大された領域を表します。安定した棘（白い矢印の頭を）実証BとCの箱入り樹状分岐の（D、E）高倍率では、/後退の棘（赤い矢印の頭）と新しい​​の棘（緑の矢印の頭を）失った。スケールバーは= Aは200μm、B、Cの20μmの、D、E.は5μm。