使用する絶縁マウスハーツの心機能およびエネルギー論の評価 31 P NMR分光法

サマリー

と一緒にランゲンドルフモード単離心臓の灌流、 ³¹ P NMR分光法、一つの実験に生化学や生理学の分野を組み合わせたもの。同時に生理的な機能を監視しながら、プロトコルは、心臓の高エネルギーリン酸含有量と売上高の動的な測定が可能になります。正しく実行する場合、これは心臓のエネルギー論の評価に貴重な技術です。

要約

遺伝子組み換えマウスモデルでは、心血管疾患の分子変化とモデル間の因果関係を決定する際に強力な研究ツールとなっている。分子生物学は、シグナル伝達経路の主要な変更点を特定するのに必要ですが、それは機能的な意義の代用ではありません。生理学はそのままで代謝の生化学的評価と生理学を組み合わせた、機能の質問に対する答えを提供できる一方で、心臓を拍動する心臓の機能とエネルギー論の全体像を可能にする。長年にわたり、私たちの研究室では、このタスクを達成するために核磁気共鳴（NMR）分光法と組み合わせて単離心臓のperfusionsを活用している。心臓のエネルギー論を実行することによって測定される間、左心室機能は、ランゲンドルフモード単離心臓のperfusionsによって評価される

プロトコル

1. これらの実験では、2つの別々のシステムが同時に利用されている。 ³¹ Pスペクトルの取得については、ブルカー14Tのマグネットは、AvanceのIIIのコンソールとトップスピンV2.1ソフトウェアを装備したコンピュータとのインターフェースです。心機能の評価のために、カスタム構築された心臓の灌流システムは、データ解析のためのLabChartPro 6ソフトウェアを搭載したPowerLab 4月30日データ収集、とのインターフェースです。
2. 実験当日、クレープス-ヘンゼライト1リットルのバッファーは、次のように調製する。0.5mmのEDTA、5.3mMのKCl、1.2mmのMgSO _4を 、118mMのNaCl、および25mMのNaHCO _3を 。次いで、混合物を5％CO ₂ / 95％前に2mMのCaCl ₂を加えて10〜15分間、O ₂でバブリングする。最後に、基板は、10mMのグルコース及び0.5mmのピルビン酸の形で、追加されます。
3. 実験中の温度調節が重要です。 37.5 ° Cを中心に磁石内にあるとき - 温水循環装置は、37.0との間の温度を維持するために使用されています。温度は、光ファイバ温度プローブを用いた実験の期間が監視されています。
4. 灌流圧および左心室圧は、データ収集システムに接続されていると付属のソフトウェアを使用して表示される圧力トランスデューサを介して監視されます。これらは、実験に先立って、標準の血圧計で較正されています。さらに、圧力ラインはすべての気泡を除去するために、適切にフラッシュされます。
5. 150mMのリン酸ナトリウム（KHのバッファーのイオン強度に相当する）の標準サンプルは、前に心臓の挿入にプローブを"校正"するために使用されます。これは、信号を容易にし、心臓がプローブ内に配置されると、取得期間を開始するのに必要な時間が短縮されます。
6. 凝固を減らすために、マウスが5分後にヘパリンIPの200単位を注入され、ペントバルビタールナトリウム（175 mg / kg）のIPが与えられます。
7. 心は急速に切り出した（そのまま肺および胸腺）と氷冷KHバッファに逮捕されている。
8. 氷上に置きながら、肺はすぐに削除されます。胸腺の葉が同定され、静かに大動脈を露出するために戻って剥離されています。胸腺は削除されます。大動脈は、慎重に周囲の組織を除去することによって分離されています。
9. マイクロ縫合鉗子を穏やかに内腔を公開する大動脈の両方の壁を保持するために使用されます。大動脈を慎重に0.965ミリメートルODのポリエチレンチューブ（PE50）から作られたカニューレに配置されます。縫合糸がすぐに大動脈周囲に結び付けられている間に大動脈をミクロ血管クランプで固定されています。クリップが削除され、鉗子は慎重にカニューレを大動脈基部より上であることを確認するために使用されます。追加の関係はその場で心臓を保持するために必要に応じて追加されます。
10. 余分な組織は、鉗子とmicroscissorsを使用して削除されます。小切開は、左心耳に行われます。優しく心を保持している間に0.61ミリメートルODのポリエチレンチューブ（PE10）を慎重に頂点を介して左心房、左心室腔、および出力を介して挿入されます。過剰なチューブがトリミングされます。
11. デフレート水で満たされた風船は、LVにアトリウムを介して挿入され、粘着テープや糸を使用して所定位置に保持される。蠕動ポンプの速度は徐々に心臓に十分な流量を提供するために増加しています。心臓は、NMRプローブに場所になるまで、心臓は約2ml /分に相当する一定の流量で灌流され続けます。 LVのバルーンは、LV圧変換器が機能していることを確認するためにマイクロシリンジを用いて、少量で膨らませている。
12. 心臓は慎重に10 mmのNMR管に挿入されます。ワイドボア"スピナー"は、プローブ内の適切な位置にチューブを誘導するために使用されます。装置全体は、しっかりと粘着テープで"臍帯"に添付されます。
13. 心臓/ NMR管は10mmのNMRプローブのコイルの内側になるまで、臍帯は、徐々に磁石の上部の穴に低下する。
14. 心臓は、プローブ内の適切な位置になると、蠕動ポンプの流量は、80mmHgの灌流圧を達成するために調整されます。 （この時点まで心臓が約2ml /分の一定流速で灌流されていることを、覚えておいてください）​​。灌流圧は、ポンプのコントローラ上の"ホールド"のメカニズムを有効にすることで維持されています。心臓は、その後15〜20分の平衡期間を許可されています。その間、LVのバルーンの体積は80〜10 mmHgの拡張末期圧を達成するために調整されます。
15. 平衡期間中に、それは可能な限り最高のリン信号を得るために、分光器のパラメーターを最適化する必要がある。これは、リン核が共振する周波数での電波のパルスを設定する（"チューニング"）と（"シム"）磁場を均一にすることによって達成されます。
16. 平衡期間の後、複数の³¹ P NMRスペクトルを得ることができます。各スペクトルの取得周期はtに依存しています彼はフィールドの磁石の強さ、標本の大きさ、および特定の実験に必要な信号対雑音比。スペクトルは、60度のフリップ角と2.0秒の遅延で20μsの256無線周波数パルスから得られる信号を平均で14 Telsaの磁石を使用して取得されます。この実験では約10分が必要になります。

代表的な結果

データ集録ハードウェアとLabChartソフトウェアから、心機能のいくつかのパラメータは、実験プロトコルを通して測定することができます。心機能の代表的な指標は、左心室に開発圧力（LVDevP）は、収縮期血圧（図1）から拡張末期圧（EDP）を差し引くことにより得られる。この措置は、マウスの系統および心臓の状態（すなわち、圧力の過負荷）によって異なる場合があります。しかし、通常のC57BL6マウスの心臓でLVDevPは8-10 mmHgの固定拡張終期圧で100から110 mmHgの間に典型的です。さらに、LabChartのプログラムは、LVの圧力波の周期測定値に基づいて、心拍数の測定が可能になります。再び、この措置は変わることができますが、心は本質的な速度で打つために許可されているときに典型的な値は、350〜400 BPMです。しかし、心臓は、心拍数は420 BPMに保たれているペーシングシステムを使用して標準化することができる。さらに、収縮性（+ DP / DT）とリラクゼーション（-dP/dt）の措置がLVの圧力波の一次導関数を用いて推定することができます。実験プロトコール中には、圧力 - 体積の関係を組み込むことにより、スターリングのメカニズムを評価するのは簡単です。これは、LVのバルーンのボリュームが徐々に増加することとLVDevPだけでなく、EDPに注目することによって実現されます。これらの値は、図2に示すようにプロットすることができます。スターリング曲線が適しているが、80〜10 mmHgのEDPを達成するために必要なボリュームを指摘するLV室の寸法の間接的なアイデアを与えることができます。これは、拡張した心臓はコントロールに比べてより大きな音量を必要としながら肥大した心臓は通常、小さなバルーンのボリュームが必要になるからバンディング大動脈のモデルで使用することができます。表1は、灌流プロトコル中に取得された代表的な心機能のデータが表示されます。

³¹ P NMR分光計は、クレアチンリン酸の信号（PCR）とATP（γ- ATP、α- ATP、およびβ- ATP）と同様に、図2に示すように、無機リン酸塩（Pi）から三リン酸を提供します。これらのピークの各々の分析は、曲線下面積の値を提供します。 ATPの量は、γ- ATPとβ- ATPの領域を平均化することで推定される。 （NAD分子は全体の信号の未知の部分に寄与するので、α- ATPが使用されていない）。心の精力的な状況は、PCRおよびATPの分野の商（：ATP比PCR）によって決定されます。 1.7主な基質としてグルコースに付属のマウスの心臓で - この値は通常1.5です。 ³¹ P NMRは、ATPまたはPCRの直接的な対策を提供していませんが、ピークの面積は、サンプル中の化合物を含有するリンの量に比例する。これらの信号の値は、他の方法を用いて推定することができます。例えば、心のコホートにおける高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によるATPの直接的な対策は、平均的な濃度を得ることができる。この値は、スペクトルで観測された平均的なATPエリアを校正するために使用することができます。 PCRの濃度は、ATPの領域に相対的なPCR領域に基づいて計算することができます。それは、PCRの信号に無機リン酸塩（Pi）信号の相対的な化学シフトを分析することによってpHを推定することも可能です^。1は、異なる無線パルスシーケンスを使用して、クレアチンキナーゼの反応速度やATP合成の反応速度も測定することができる^2。

表1。孤立した灌流心臓からベースラインの心機能。 LVDevP：左心室開発圧力、LVEDP：左室拡張末期圧、HR：心拍数、RPP：速度圧製品; + DP / DT：一次導関数LV圧正、-dP/dt：一次導関数LV圧負、PP ：灌流圧、CF：冠血流。

LabChart Proソフトウェアから図1。代表LVの圧力波。

図2制御（実線）と大動脈バンド（点線）マウスからの代表スターリング曲線。 A）などの増加LVのボリュームにLVDevPで表される収縮機能は、LVのバルーンの体積によって決まります。 B）拡張機能をのようなLVのバルーンの体積によって決定された左室容積を増やす以上のEDPで表される。 LVDevP：左心室開発した圧力（収縮期マイナス拡張期Pressure）、EDP：拡張末期圧。

孤立した灌流マウス心臓の図3。代表³¹ P NMRスペクトル。比較的小さなパイのピークに注目してください。グルコースに加えて、ピルビン酸や脂肪酸に付属の好気的に灌流心臓においては、このピークは必要最小限にとどめます。虚血の期間中、このピークが増加するPCRのピークは減少する。 α- ATPピークの右側の肩に注目してください。これはNAD分子の寄与である。 π：無機リン酸塩、PCR：クレアチンリン酸、ATP：アデノシン三リン酸。

ディスカッション

ランゲンドルフ灌流絶縁マウスの心臓の³¹ P NMR分光法は、信頼性と再現性のあるデータを提供します^。3、4はしかし、それはLVのバルーンの大動脈と挿入のカニュレーションが安定した心機能を可能にするために適切にそのように行われていることが不可欠であるNMR内側間チューブ。さらに、温度​​調節は適切なベースラインの機能を達成するために重要です。良い、分析可能なNMRスペクトルを得る重要な要因の1つは、信号対雑音比を増加している。これは、最適な"チューニング"とサンプルの"シミング"を確保することによって達成することができます。プロトコルのテキストで述べたように、前に心臓の挿入に標準サンプルの使用は、これを容易にすることができます。適切なサイズの"サンプル"を持つことも役立ちます。取得時間の増加が良好なリンのスペクトルを得るために必要となるので、100未満mgを秤量ハーツは、通常より低いPCRおよびATPの信号を提供します。

心機能とエネルギー論に関する追加情報を集めるために、既存のプロトコルを変更するには、いくつかの方法があります。当研究室では、我々は脂肪酸のさまざまな組み合わせが存在する（低および高濃度で）、乳酸、ケトン、およびインスリンを含むことができる混合基質を緩衝液で灌流心を持っている。潅流液（すなわち^、13 C標識基質）の安定同位体を使用することで、我々はTCAサイクルへの標識アセチルCoAの相対的な寄与によって基板の使用率を予測する能力を持っている。このアプリケーションでは^5-7、我々は、アイソトポマーを実行する¹³ C3 -および¹³ C NMR分光法と¹³ C4 -グルタミン酸の分析。これは血流プロトコルの終わりに心を凍結クランプと凍結組織の抽出を行う必要があります。これは、分析は別のセットアップパラメータを持つ別のプローブを使用する必要があるとして、追加の実験になります。 ³¹ P NMR分光法を用いて心臓の2 -デオキシグルコースリン酸塩の時間依存の蓄積を監視しながら、他のアプリケーションは、バッファ内のデオキシグルコースとグルコースの置換が含まれています。このメソッドは、心筋のグルコース取り込みを測定することができます。加えて^7、8、私たちの研究室では、虚血/再灌流およびワークロードの高い課題から構成される灌流プロトコルにおける心機能およびエネルギー論を分析している^6、8-10

要約すると、分離されたマウスの心の中で³¹ P NMR分光法は、高度な機器の使用を要求する技術的に困難な手順です。しかし、それが得られること、データは、遺伝子組み換えマウスモデルの機能とエネルギー論を分析することを望む研究者に貴重なものです。当研究室では、これらの技術は心臓機能、エネルギー論、および代謝上のストレッサーの様々な影響についての我々の理解に不可欠れている^1、11、12

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
硫酸マグネシウム	試薬	Sigma-Aldrich	M7506
EDTA	試薬	Sigma-Aldrich	E1644
塩化カリウム	試薬	Sigma-Aldrich	P4505
重炭酸ナトリウム	試薬	Sigma-Aldrich	S6297
塩化ナトリウム	試薬	Sigma-Aldrich	S7653
塩化カルシウム二水和物	試薬	Sigma-Aldrich	C5080
D-グルコース	試薬	Sigma-Aldrich	G7528
ピルビン酸ナトリウム	試薬	Sigma-Aldrich	P2256
Bruker Ultrashield 600WB Plus	Equipment	Bruker Corporation
PowerLab 4/30	Equipment	ADInstruments	ML866/P
LabChart 6 Pro	Equipment	ADInstruments	MLS260/6
Quad Bridge Amp	Equipment	ADInstruments	ML224
STH Pump Controller	Equipment	ADInstruments	ML175
Minipuls 3 蠕動ポンプ	Equipment	ADInstruments	ML172
ディスポーザブルBPトランスデューサ	Equipment	ADInstruments	MLT0699
10mm NMR サンプルチューブ	装置	Wilmad LabGlass	513-7PP-7
ポリエチレンチューブ PE10	機器	BD Biosciences	427401
Physiological Pressure Transducer	Equipment	ADInstruments	MLT844
ポリエチレンチューブ PE50	機器	BD Biosciences	427411
マイクロメータ シリンジ	機器	ギルモント・インスツルメンツ	GS-1101
マクファーソン鉗子	装置	ミルテックス社	18-949
Castraviejoマイクロハサミ	機器	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5650
Neoptixシグナルコンディショナ	機器	Neoptix, Inc.	反射神経 - 1