細胞機能上の基層の剛性の影響をモデル化することができます in vitroで様々なコンプライアンスはのポリアクリルアミドハイドロゲルを使用。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
組織の剛性は、細胞機能の重要な決定因子であり、組織の硬さの変化は、一般的に線維症、癌、心血管疾患1月11日に関連付けられています。細胞機能を研究するために、従来の細胞生物学的なアプローチは、弾性ECMや組織間のECMの剛性の変動の影響を考慮することはできません堅い基層上の培養細胞を（プラスチック製の皿やガラスのカバースリップ）を伴います。 in vitroでの生体組織のコンプライアンスの条件でモデルに、我々と他のECMコーティングされたハイドロゲルを使用してください。当研究室では、ヒドロゲルは生物学的に12見た組織のコンプライアンスはの範囲を模倣することができるポリアクリルアミドに基づいています。 "リアクティブ"カバースリップは3 APTMSを加えて水酸化ナトリウムとのインキュベーションによって生成されます。グルタルアルデヒドは、3 APTMSとポリアクリルアミドゲルを架橋するために使用されます。アクリルアミド（AC）、ビスアクリルアミド（ビス- AC）および過硫酸アンモニウムの溶液をハイドロゲルの重合に使用されます。 N -ヒドロキシスクシンイミド（NHS）は、ハイドロゲルに架橋ECMタンパク質にACのソリューションに組み込まれています。ハイドロゲルの重合に続いて、ゲルの表面は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンなどの選択肢のECM蛋白質で被覆されている
ハイドロゲルの剛性は、レオロジーや原子間力顕微鏡（AFM）によって決定され、溶液12にACおよび/ またはビス- ACの割合を変えることによって調整することができます。このように、基層の剛性は、レオロジーやAFMを用いて定量することができる生体組織の硬さに一致させることができます。次いで、細胞をこれらのヒドロゲルに播種し、必要な実験条件に基づいて培養することができる。分子解析のための細胞とその回復のイメージングは簡単です。この記事では、我々は20,000パスカル<3000パスカルと硬い基層/組織Eを持つものとして>弾性率（E）を有するものとして、ソフト基層を定義します。
プロトコル
準備
- カバースリップはオートクレーブする必要があります。
- 滅菌蒸留水または脱イオン水は、溶液を調製し、洗浄のカバースリップのために使用する必要があります。
- AC（40％w / v）とビス- AC（1％w / v）のソリューションは、0.2μmのろ過滅菌されています。使用直前および滅菌フィルターの前に、10％過硫酸アンモニウム（100μg/ml水APS）を準備する。毎月のAPSソリューションを交換してください。
- オートクレーブできないような3 - APTMS、クロロホルム、glutaradehyde、NHS、およびSurfaSilなどの化学試薬は、ヒドロゲルの調製のためにのみ使用される割り当てられた瓶に保管されています。
- 最良の結果を得るには、ハイドロゲルは、適切なECM蛋白質との一晩のインキュベーションの後数日以内に利用されるべきである。
- ハイドロゲルの注ぐ前に50ミリリットルポリプロピレンファルコンチューブにクロロホルム（10mlは通常十分なトップ20カバースリップ用です）の10％SurfaSilの溶液を調製します。 （私たちの研究室は、通常0.5％のグルタルアルデヒドのインキュベーションステップの間にトップカバースリップをsiliconizes）。少なくとも10分間ファルコンチューブやロックにカバースリップを追加。 SurfaSilソリューションをデカントし、空気は、ヒドロゲルが準備される生物学的安全キャビネットの....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
ハイドロゲルの重合プロセスの重要な要素は、細胞がガラスのカバースリップではなく、ECMコーティングされたハイドロゲル自体にバインドできるようにする気泡の形成を避けるためです。これは、慎重にボルテックスし、視覚的に気泡がゲル中に閉じ込められたとなっていないことを確認した後、重合溶液をピペッティングすることによって防ぐことができます。私たちは、常に実験のために十分なことを確認するには、追加の"反応"カバーガラスとハイドロゲルを準備することをお勧めします。
ゲルをPBSで洗浄されるたびに特に注意を払う必要があります。吸引のプロセスは、それがキャッチし、引き裂かれるかもしれませんとしてヒドロゲル自身との密接な接触を避ける必要があります。ヒドロゲルを乱すことなく、液体を吸引するための最も安全な方法は、吸引しながらプレートを傾けることです。
それは完全にレベルヒドロゲルを得ることが困難であり、そしてハイドロゲルの厚さの微細な違いは、それが難しいの視野全体に映像を集中するように凹凸が発生する可能性があります。一つは、比較.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
仕事は、私たちの研究室は、国立衛生研究所からの助成金によってサポートされています。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| グルタルアルデヒド, 70% | Sigma-Aldrich | G7776 | -20°Cで保存 |
| 3-APTMS (3-アミノプロピルトリメトキシシラン 97%) | Sigma-Aldrich | 281778 | 室温で保存 |
| SurfaSil シリコナイジング液 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 42800 | 室温で保存 |
| NHS (N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル) | Sigma-Aldrich | A-8060 | 4°Cで保存、毎月更新 |
| ウシ血清アルブミン, 実質的に脂肪酸フリー | Sigma-Aldrich | A6003-100G | 4°Cで保存 |
| カバーガラス (25mm) | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | |
| カバーガラス (18mm) | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |
参考文献
- Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta. J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).
- Bernini, G. Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibros....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
