HIV - 1の表面のエンベロープ糖タンパク質（gp120の）の別のV3のループシーケンスの冠の領域は、構造的にポジションのインシリコのフォールディングにによって多くのケースで特徴づけることができる最新鋭のを使用してループの10から22第一原理折りたたみアルゴリズム。ここでは、HIV - 1のR2株、不可解な機能特性を持つユニークな中和感受性株からのV3ループのこの地域の折りたたみと評価を示しています。
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方法論記事
によるHIV - 1 V3ループクラウンR2シーケンスの免疫学的に関連する動的第三紀の構造的特徴の評価第一原理折りたたみ
この記事について
サマリー
要約
HIV - 1の抗原の多様性は、長い間ワクチンの設計への障害となっており、この変動は、特にウイルスの表面のエンベロープ糖タンパク質のV3ループの中で発音されます。我々は以前、ダイナミック、シーケンス変数が、V3ループの王冠と提案した免疫学的に関連するβ-ヘアピン三次構造へのHIV - 1ウイルスの人口全体に制約されます。重要なのは、別のV3ループの王冠のシーケンスの数千は結晶学やNMRによることが困難または不可能なウイルスの多様性全体の動向の3次元構造解析を行う、HIV - 1ウイルスの循環でもあります。 V3王冠1、2の折り畳みと私たちの以前の成功した研究では、ICM - Proの分子モデリングのソフトウェアパッケージ（Molsoft LLC、ラホーヤ、カリフォルニア州）でアクセス可能なのab initioのアルゴリズム3を使用して示唆されたV3ループの王冠、特にから位置10から22、それは溶液中で自由に折りたたみ式の制約のないペプチドであるかのように大規模な程度に動作するように十分にその隣接茎の柔軟性と長さから利益を得る。 60,000個々の株のV3ループのちょうどこの部分のような、急激なのab initioフォールディングとして+循環HIV - 1株は、有益なことができます。ここで、我々は、そのユニークな特性の構造的基盤への洞察を得るためにR2株のV3ループを折ら。 R2は、患者の血清およびモノクローナル抗体4,5による中和にこの株の絶妙な感度の責任であると考えられる稀なV3のループシーケンスを負いません。ひずみCD4非依存性感染症を媒介とは、広く中和抗体を誘発するために表示されます。我々は、折りたたみの結果の評価がR2のために観察された免疫学的活動と折りたたみで観測された構造を関連付けるための有益なことができる方法を示しています。
プロトコル
1。方法
- プロトコルの最初のステップでは、in silicoでフォールドするV3王冠のシーケンスを選択することです。 R2の株について、このフラグメントのシーケンスはKSIPMGPGRAFYTです。
- この配列に相当するペプチドの三次元原子構造は、コンピュータの仮想空間に構築する必要があります。このためにICMのコマンドは次のとおりです。
buildpep"KSIPMGPGRAFYT"
または[ファイル：新規：ペプチドは、プルダウンメニューで選択することができます - 手順のいくつかのパラメータは、検索のステップ数（検索の長さ）、シミュレーションの温度、バイアス合理的な分野、エネルギーの観点から、異なるエネルギーの計算方法の選択に向かって検索を変数に制約を含む検索戦略パラメータを含む、設定されていますと検索がこのようなムービーを記録するかどうかとして記録し、どのように多くの中間得点コンフォメーションする方法を示すパラメータが記録されることが望ましい。すべてのこれらのパラメータは、以前の出版物（www.molsoft.comを参照）によって最適化されています。
- 折りたたみは、次のコマンドを使用して開始されます。
モンテカルロ
または[ファイル：新規：ペプチドは、メニュー分子力学プルダウンで選択することができます。最小化：グローバル
前者の場合には、ステップ3からのパラメータは、コマンドラインで一つ一つ設定する必要があります。コマンドが実行される前に、後者のケースでは、最も一般的に選択したパラメータのチェックボックスがペインに提供されています。便宜上、この実験と以前に公表された実験に利用したのと同じ折りたたみICMのスクリプトはここに示されています：
このスクリプトは、テキストファイルに保存され、急速にコマンドを使用してコンピュータのオペレーティングシステムのコマンドライン（通常、Linux）から実行できます。
ICM _foldingscript
2。成功の秘訣
- V3ループは、ほとんどすべての既知の菌株の長さが一定の35アミノ酸であり、アミノ酸の位置は1でシスチン結合元のジスルフィドから始まり、35でシスチン結合に対応するジスルフィドで終了する1〜35に番号が付けられていますので。それがループの一部なので、V3の王冠の境界は慎重に選択する必要があります。大きすぎるフラグメントが選ばれているなら、それは遊離ペプチドであるかのように自由に柔軟なセグメントとして動作する可能性は低い、折り畳みシミュレーションが正しく構造を評価しないように。小さすぎるフラグメントが選択されている場合は、有益な三次構造は、シミュレーションで形成されないことがあります。私たちの以前の研究では、位置10から位置22へのフラグメントは、抗体結合結晶コンフォメーションと相関することを示したので、これは折り畳みのために選択する必要のあるすべてのV3ループの断片です。
- グラフィカルユーザーインタフェースを使用しているがとプルダウンメニューは、ICMとスクリプト上で使用した特定のV3ループの王冠のフォールディングを使用して、一般的にペプチドの折りたたみに関するユーザーフレンドリーな、成功する前の仕事、単にbuildpepラインにシーケンスを変更および実行することです。コマンドラインから上記スクリプトの使用をお勧めします。
3。代表的な結果
R2の折りたたみの結果は任意のV3ループの結果の代表的なものである。結果を評価するために、プロジェクトファイルは、（それが上記のスクリプトから"newProject1.icb"という名前になります）選ばれた"と分子力学、スタックは、表示"を開き、必要があります。スタックのコンフォメーションの表が表示されます。スタックのコンフォメーションは、プロット/ヒストグラムアイコンをクリックして、グラフィカルに可視化することができる。 "分子力学、スタック、プレイは"視覚的に折りたたみ式によって発見された立体配座の好みを理解するためにスタックのムービーを作成します。 α-ヘリックスのコンフォメーション、特に明確なβ-ストランドの設定がスタック全体に見られる12から14の位置にある断片で、そして非常に少数- R2のシーケンスの場合は、コンフォメーションは、β-ヘアピン等のV3ループ2に期待されている見られている。さらに、約3単位のエネルギーギャップは、最低エネルギーコンフォメーションと番目に低いエネルギー配座の間に見られる。エネルギーの観点から、この手段時間の1％未満の最低エネルギー配座の構造のみがちらつくていること：折り畳み式の結果は、したがって、R2 V3王冠が硬いのではなく、柔軟性、構造であることを示唆している。そこにコンフォメーションのアンサンブルにおける他の重要な構造的特徴であるが、それらは体系的に理解することが困難である場合があります。
| JRFL | SF162_V3JRFL | SF162_V3R2 | |
| 447 - 52D GMT 50 | 15 | 0.00061 | 0.00078 |
表1：マスクとマスクされていない設定でJRFLとR2 V3ループの相対的な中和。データは、以前はカルドソT.、 ら。ARHR（200で報告された8）とピンター、A.、 ら。ら J. Virol（2004）。 SF162_V3JRFLが含まれていますJRFL：簡単に言えば、中和活性は、env -欠陥ルシフェラーゼ発現JRFL Envのまたは上記SF162 V3の亜種でシュードpNL4 - 3.Luc.RE -プラスミドで生成されたpsVsを使用して単一サイクルの感染性試験により測定したSF162 V3のループシーケンスの代わりにV3のループシーケンス。 SF162_V3R2はSF162 V3のループシーケンスの代わりにR2のV3のループシーケンスが含まれています。 psVsは、37で1.5時間のための447 - 52D mAbの連続希釈液° Cをインキュベートし、ポリブレンの存在（10 mgの= mL）を96ウェルプレートに播種CD4 + CCR5 + U87標的細胞に添加した。 24時間後、細胞をインキュベーションの追加の24〜48時間で10％FBSおよび10 mg = mLのポリブレンを含むRPMI培地でrefeedの過去過去分詞形れました。ルシフェラーゼ活性はプロメガからアッセイ試薬を用いてマイクロタイタープレートルミノメーター（HARTA、（株））と48〜72時間の感染後に決定された、447 - 52D 50％の中和（GMT50）のための（株）幾何平均力価は、中和曲線から補間により決定され、少なくとも3つの独立したアッセイの平均値である。
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ディスカッション
のab initioの折りたたみは、三次構造上の特性、順次個々のアミノ酸の研究から明らかでないかもしれないの効果を明らかにする。 R2 V3ループ王冠のいくつかの以前に無名の構造特性は、フォールディングシミュレーションによって明らかにされています。これらの観測された構造的な好みは、中和とhyperinfectivity 5〜感度すなわち、R2のひずみの観測機能的特性と相関することがあります。
最初に、位置12から14時R2のV3の王冠のN末端側半分の明確なβ-ストランドの傾向が観察される。これはR2の歪みの珍しいイソロイシン - プロリン-メチオニン（IPM）のシーケンスの位置です。結晶447 - 52Dの構造、2219、Be48、2557、2558とV3ループペプチドに結合した537 - Dの抗V3ループの抗体から、V3ループの位置12〜14、バインドされたときに、これらの抗体によって結合し、とされていますセグメントは、地元のβ-鎖コンフォメーションを採用しています。折り畳みシミュレーションはこのようにR2 V3ループ王冠は既知の抗V...
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
作業は、DP2 OD004631とR01 AI084119を含む、ビルアンドメリンダゲイツ財団（＃38631）とNIHからの補助金によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ICM-Pro | Molsoft LLC |
参考文献
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Zolla-Pazner, S. &, Cardozo, T. Dynamic characterization of the V3 loop crown. Antiviral Therapy. 12, 13-31 (2007).
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Swetnam, J., Zolla-Pazner, S., Cardozo, T. Structural conservation predominates over sequence variability in the crown of HIV type 1's V3 loop. AIDS Res Hum Retroviruses. 26, (2010).
- Abagyan, R., Totrov, M. Biased probability Monte Carlo conformational searches and electrostatic calculations for peptides and proteins. J Mol Biol. 235, 983-1002 (1994).
- Quinnan, G. V., Zhang, P. F., Fu, D. W., Dong, M., Alter, H. J. Expression and characterization of HIV type 1 envelope protein associated with a broadly reactive neutralizing antibody response. AIDS Res Hum Retroviruses. 15, 561-5670 (1999).
- Zhang, P. F., Bouma, P., Park, E. J. A variable region 3 (V3) mutation determines a global neutralization phenotype and CD4-independent infectivity of a human immunodeficiency virus type 1 envelope associated with a broadly cross-reactive, primary virus-neutralizing antibody response. J Virol. 76, 644-655 (2002).
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再版と許可
