勉強する in vivoで腫瘍の増殖と腫瘍微小環境、我々は、免疫動物の卵巣癌の同系と同所性マウスモデルを使用。我々はKatushka蛍光タンパク質（MOV1でマウスの腫瘍細胞株（MOV1）を形質導入 KAT）と、ここでは、卵巣での同所移植を示し、 in vivoでイメージング。
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この記事について
サマリー
要約
背景：卵巣がんは一般的にケース/致死率が高いため、米国の女性は1,2,3の間で、すべての婦人科悪性腫瘍の最も致命的なまま進行した段階で診断されます。漿液性腫瘍は卵巣癌の最も広く普及している形ですと4,5 TG - MISIIR - TAGトランスジェニックは、自発的に腫瘍のこのタイプを開発する唯一のマウスモデルを表しています。ミュラー阻害物質II型受容体（MISIIR）遺伝子のプロモーター6の制御下TG - MISIIR - TAGマウス急行SV40形質転換する地域。追加のトランスジェニック系統は、発現するSV40タグの導入遺伝子を同定されているが、卵巣腫瘍を発症しない。非腫瘍傾向のあるマウスは、C57BL / 6マウスの一般的な寿命を示し、肥沃です。これらのマウスは、TG - MISIIR - TAG - DR26マウスから単離した腫瘍細胞に対する同系移植のレシピエントとして使用することができます。
目的：腫瘍イメージングは7可能ですが、深い腫瘍の早期発見が小さい生きている動物に挑戦する。漿液性卵巣癌の免疫学的に無傷の動物モデルにおける前臨床試験を有効にするには、我々はin vivoイメージング、腫瘍微小環境と腫瘍免疫応答の研究で可能に卵巣癌のこのタイプの同系マウスモデルを説明します。
方法：我々は最初の26週齢のDR26 TG - MISIIR - TAGの女性で収穫された自発的な卵巣腫瘍からTAG +マウスの癌細胞株（MOV1を）派生。その後、我々は安定Katushka、635分の588 nmの8,9,10での励起/発光極大を持つイソギンチャクEntacmaea quadricolorから赤色蛍光タンパク質の遠赤変異体をコードTurboFP635レンチウイルス哺乳類ベクターとMOV1細胞を形質導入。我々は、同所の非腫瘍が発生しやすいTG - MISIIR - TAG雌マウスの卵巣11,12,13,14でMOV1 キャットを注入。腫瘍の進行は 、in vivo光イメージングおよび腫瘍微小環境で続いていた免疫組織化学により解析した。
結果：同所移植MOV1 キャット細胞は漿液性卵巣腫瘍を開発した。 MOV1 キャットの腫瘍は最大3週間注入後in vivoイメージングで可視化することができる（図1）とのようなヒト卵巣癌15（図2）で観察された白血球、で浸潤した。
結論：我々は、深部組織のKatushkaの高いpH安定性と光安定性のために早期の腫瘍のin vivoイメージングに適した卵巣癌の同所性モデルを記述する。我々は、腫瘍免疫応答と免疫療法のin vivoイメージングの研究とモニタリングのための漿液性卵巣癌のこの小説同系モデルの使用を提案する。
プロトコル
1。細胞の文化
- 同所性注入の前に、T175フラスコにDR26腫瘍由来の培養MOV1 キャット細胞 、、彼らは90％コンフルエントになるまで。 1または2 T175フラスコを必要とする注射1〜5万セルを、使用する予定。
- 注射の日に、細胞を収穫し、血球計算盤を用いて細胞数を決定します。
- 一度細胞濃度は、室温で300 × gで5分間、遠心分離によって細胞がペレット、決定されている。
- スピンに続いて、0.002 M EDTAを滅菌PBSの10マイクロリットルで100万人を持っている細胞を再懸濁
2。手術前
- 手術前に、PBS EDTAの10マイクロリットルで100万MOV1 - キャット細胞と3/10ccインスリン注射器をいっぱいに。
- 加熱パッドにイソフルラン麻酔マウスを転送します。目の脱水を防ぐために、眼軟膏を追加。その後、すぐに手術中麻酔を提供するためにイソフルラン気化器に接続されたノーズコーンのシステムに動物の頭を挿入する。
- アルコール綿棒で注射部位の消毒した後、皮下3/10ccインスリン注射器で、ケトプロフェン、術前鎮痛剤の5 mg / kgを注入する。
- バリカンを使用して、動物の尾の基部に胸腰椎接合部から背側の左尾部を削る。完全に毛を除去する除毛クリームを適用します。その後、ぬれたペーパータオルで余分を削除してください。
- 髪が削除されると、ポビドンヨードおよびアルコール綿棒で剃毛面積を滅菌する。その後、切開の周辺手術ドレープを置きます。
3。手術
- ただ手術前に、1.5％イソフルレン気化器のレベルを調整します。
- 動物の足のパッドをつまんで完全に麻酔していることを確認します。
- 次に、皮膚の下に脾臓を見つけます。その後、外科はさみを使用すると、脾臓の右上に1〜2センチの背側切開を行います。
- 後腹膜の解剖。マウスの卵巣を取り囲むパッドが観察されます。マウスの卵巣を取り囲む脂肪パッドを把握し、公開する湾曲鉗子を使用してください。
- 滅菌PBSを数滴と水和物器官。
- 位置...撤回、把握することが曲がったピンセットを使用して、...して、注射のため卵巣を確保する
- しっかりと鉗子で卵巣をつかんで、卵巣にMOV1 キャット腫瘍細胞の10マイクロリットルを注入。しっかり理解し、流体逆流や漏れを防止します。
- すぐに注射後、鉗子によって発揮される張力を解放する。卵巣の穿孔は、自発的に撤回し、閉じる必要があります。
- 針に接続されている吸収性ポリグリコール酸縫合糸を使用して、レトロ腹膜傷を閉じます。
- ノーズコーンから動物を離します。
- 皮膚をストレッチし、組織接着剤を数滴で背傷のエッジを封印。
- 最後に、経口で動物に抗生物質を100マイクロリットルを管理する。その後回復のためのケージやモニターでそれを取り付けなおします。一週間のために飲料水における抗生物質の動物を保管してください。
（4）in vivoイメージング
- MOV1 キャット腫瘍細胞の同所性注入後一週間は、in vivoイメージングで行います。イメージング室にイソフルラン麻酔マウスを転送することから始めます。
- 2％イソフルレン気化器のレベルを下げてください。
- イメージングシステムの製造元の指示に従ってin vivoイメージングで実行します。このビデオでは、ルミナのシステムが使用されます。
- 画像に、リビングの画像ソフトウェアのデスクトップのアイコンをクリックします。その後、IVISの取得コントロールパネルで、"初期化"を選択します。本器の設定は、カメラの設定に類似しています
- 買収のコントロールパネルに、測定器の測定パラメータを設定します。蛍光については、"蛍光灯"をオンにします。各画像と写真を取得するために写真のボックスをクリックします。
- 次に、Autoとして露光時間を設定します。 "ピクセルビニングまたはCCDの解像度"の下に、"ミディアム"をチェック。その後、F /停止や開口の下で、2の値を確認してください。次に、535励起フィルターおよびDsRed発光フィルターを選択します。
- 視野の下に、画像の単一のマウスのためにビューBをクリックしてください。
- その後、画像取得を開始するために取得するをクリックしてください。
- 画像の取り込みが完了すると、関心領域、またはROI、信号の測定するツールを使用してください。信号の値と領域を解放するために、測定のアイコンをクリックしてください。
- 最後に、ユーザーのフォルダに画像を保存する"保存"をクリックしてください
- 画像が保存された後、イソフルランの投与を中止し、そのケージにマウスを返します。マウスはすぐに目を覚ます必要があります。
5。代表的な結果
- 使用してこのプロトコルを、同所性卵巣癌のin vivo増殖非侵襲的な手順を使用して、少なくとも3週間は監視することができます。
図1。ネガティブコントロールとしてMOV1 キャット細胞 、またはPBSは、同所。非腫瘍傾向のあるマウス（それぞれ右動物と左動物と）の卵巣に注入し、in vivoイメージングでは 2週間後に行われた。卵巣の生着MOV1 キャット細胞によって生成された蛍光発光を測定し、陰性対照マウスからのそれと比較した。
図2。MOV1 キャットの卵巣腫瘍の凍結切片をモノクローナル抗体は、腫瘍浸潤リンパ球（黒い矢印）を検出するためのDAB基質（ダークブラウン）に続いてビオチン化抗- CD4で染色した。細胞は、細胞核（青）を可視化するためにメチルグリーンで対比染色した。腫瘍細胞は、（赤矢印）、T細胞からの形態学的に異なるいた。スライドは、40倍拡大表示されます。
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ディスカッション
手術と同所注射
卵巣嚢における同所性注入は、トレーニングと精度が要求されます。このように
- 貧しい手術経験の場合、最初の死体との練習。
- 彼らは未経産の雌と比較して注入し、増加の生存を容易に時間をかけて大きな卵巣を開発するように優先的に初産の女性を（1つまたは2つのリットル）を使用してください。
- マウス卵巣嚢の小さなサイズのため、可能な最小の針サイズの使用が強く推奨されています。
生体内撮像
- 例えばPBS 1mlの100μlに6月 10 日〜7月 10 日 MOV1 KAT細胞で満たさ1.5ミリリットルependorfチューブとして、蛍光の基準を常に使用します。
- 蛍光バックグラウンドを減らすためにアルファルファを含まない食事で動物を餌。
- バックグラウンドを減らすためにin vivoイメージン...
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
この作品は、NIHの助成金P01 AI 068730（SNC、NS）、NIHの助成金CA016520 / TAPITMAT（NS）、Claneil財団（NS）、および卵巣SPORE助成金からFCCCへの民間資金とペンシルベニア大学（によってサポートされていましたP50 CA83638）とフォックスチェイスがんセンターコアグラント（P30 CA06927）（DCC）。著者らは、ペンシルベニア癌の大学で博士G. Danet -デスノイヤーズ監督幹細胞および異種移植片のコアからペンシルベニア州、アンソニーSecretoの大学で博士EJ Delikatny監督光/生物発光の中核施設の優秀な技術支援に感謝手術を支援するためのペンシルベニア州/ OCRC大学の同所性の注入法とDenada DangajへのトレーニングSNCのためのセンター。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| DMEM-GLUTAMAX | Invitrogen | 10564-011 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14040 | |
| Versene | Lonza Inc. | 17-711E | |
| ヒートパッド | Deltaphase | 39 DP | |
| ポビドンパッド | Dynarex | 1108 | |
| アルコールパッド | Fisher Scientific | 06-669-62 | |
| 人工涙液軟膏 | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 17845-153 | |
| ケトプロフェン | Fort Dodge Animal Health | ||
| 3cc インスリン用注射器 | BD Biosciences | 309301 | |
| ポリグリコール酸縫合糸/針 (3/8 19mm) | Syneture | 9612-31 | |
| 組織接着剤 | Vetbond | 3M | |
| Vet Bactrim/経口懸濁液 | Hi-tech Pharmacal | 840823 | |
| IVIS-Lumina | Caliper Life Sciences | ||
| イソフルラン | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | J108013 | |
| ウシ胎児血清 (Qualified) | Invitrogen | 10437036 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| TurboFP635 哺乳類用ベクター | Evrogen | FP721 | |
| T175 フラスコ | cellstar | 660-190 |
参考文献
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再版と許可
