この記事では、我々は長期的な有効にするシンプルな方法論を提示 EX - OVO鳥類の胚培養。この手法は、鳥類胚における完全な光のアクセシビリティおよび/または無菌輸送を必要とする縦の実験に最適です。
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この記事について
サマリー
要約
正常と不正な形式の胚発生を促進遺伝子と微環境要因間の関係を理解することは新たな治療戦略を発見するための基本です。イメージング技術の進歩は、身体の計画の組織と成熟の定量的な調査を有効にしているが、後の段階の胚の形態形成にはあまり明確ではない。ニワトリ胚のための文化と手術操作の容易さのこのアプリケーションのための魅力的な脊椎動物の動物モデル系です。初期胚は、細胞のパターニングと運命学の1,2のための完全な光アクセスを可能にするろ紙のリング、上に短い時間のために培養することができる。このような心臓の形態形成などの勉強を高度な発達過程は伝統的に卵殻3-5の窓を通して行われますが、この手法は、ウィンドウのサイズに起因する光アクセスを制限している。我々は以前までの超音波検査6,7を経由して高分解能のイメージングを有効にして10日間、にのために六角形の重船の文化胚EX - OVO全体を簡単に計測する手法を開発した。これらの文化は、ライブの実験で使用可能なイメージングツールの種類を制限する、輸送することが困難でした。ここでは、費用対効果の高い、ポータブル環境室との改善されたシェルレス培養系を提示する。卵は、部分的に滅菌水で満たされたプラスチック製のコップに円周方向に貼付ポリウレタン膜（ラップしがみつく）によって作成されたハンモックに割れていた。ハンモックと水の下の力学が輸送によって誘発される振動を減衰させる助けながら、ハンモックの円周と深さの寸法は、両方の表面張力を維持するために重要でした。水浴を循環させ、小さなフットプリントは、実験中に連続的な温度制御を可能にするために開発されました。我々は、形態形成の欠陥または遅滞なく、少なくとも14日間この方法における培養胚に能力を発揮し、いくつかの顕微およびイメージングアプリケーションでこのシステムを採用しています。
プロトコル
1 EX -オボ文化プロトコル。：
- 受精鶏卵をインキュベート
- 受精鶏卵は13℃で保存できますCを最大5日間インキュベーション前に開発を開始せずに。赤のワインクーラーは、この温度を維持することができます。
- 72時間の37.5での連続的なロッキングの間に60％恒湿インキュベーター° Cでインキュベーション卵鈍い面を上に。
- ハンモックを準備する（図1a）
- 塗りつぶし¾ 9オンスのプラスチックのコップの暖かい滅菌水で。定期的な9オンスカップは、8cmの上部直径を有している。我々は、このサイズがここで紹介する長い時間培養アプリケーションに最適であることがわかった。
- 約20cmのラップをしがみつくカット。円周のまわりのラバーバンドを配置することによって、カップの上に貼付。プラスチックは、水の上に分散させる必要があります。バンド周りの余分なプラスチックをカット。我々は、輸送中に卵黄の分割の結果、それは卵黄の付着を防止するため、このアプリケーションのための最も適切なものにラップをしがみつく発見。
- 70％エタノールで湿らせたキムワイプ（キンバリークラーク社）とプラスチックを拭きます。
- 72時間のインキュベーション後にインキュベーターから卵を取り除く。
- ....
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ディスカッション
光アクセスと鳥類の胚の実験は、卵の殻の制約のため困難である。のウィンドウが大幅に注入し、顕微鏡を使った手術のアプローチ8のアクセス可能な微小血管の数を制限します。結果としてのみ初期胚を操作して連続観測が不可能であることができる。長期的な文化9を防止胚での表面張力の不十分な制御のためのペトリ皿を使用して初期のEX - OVOの文化は、使用が制限さでした。我々は最近、許容表面tenstion 7を維持する六角形の重さのボートを使用してこのテクニックを改善し、これらの文化は、輸送に困難でした。ここで紹介するテクニックは、この問題を解決し、大幅にマイクロインジェクションし、外科的処置を含む、用いることのできる実験手法とイメージング技術の種類を拡大する。研究は後で形態形成イベントを理解することに焦点を当てとして、この技術は現在、実験的に継続的に勉強することは不可能な開発のイベントの監視と変調が可能になります。
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 受精したホワイトレグホン鶏卵 | |||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | |||
| サランラップ | |||
| キムワイプス | Kimberly-Clark Corporation | ||
| ゴムバンド | |||
| 温めた滅菌水 | |||
| 9 oz プラスチックカップ | |||
| 直径 100 mm ペトリ皿 | |||
| 1602N サーマルエアー | GQF Manufacturing | ||
| フルオレセイン標識デキストラン (2 MDa, リン酸緩衝生理食塩水中 1% w/v) | Sigma-Aldrich | ||
| マイクロフォージ | Glassworx, Inc, St Louis MO | ||
| ガラスキャピラリー管 (内径 0.75 mm) | |||
| マイクロマニピュレーター | World Precision Instruments, Inc. | Model M3301L | |
| 蛍光顕微鏡 | Carl Zeiss, Inc. | Z20 | |
| 精密ピンセット 55-forceps | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 10-0 ナイロン手術用縫合糸 | Ethicon Inc. | ||
| チューブ | VWR international | 外径 1mm | |
| 3 mL シリンジ | BD Biosciences | ||
| 200 μL ピペッターおよびピペットチップ | VWR international |
参考文献
- Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).
- Ehrman, L. A., Yutzey, K. E.
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