この記事では、段階的に記述しようとする、一般的に使用される in vitroでアッセイ。
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この記事について
サマリー
要約
シュワン細胞は、脊髄損傷、以下の修復方法で一般的に使用される細胞の一つです。シュワン細胞は軸索再生をサポートしていると分泌成長因子の1,2により、発芽と接着分子3と細胞外マトリックス分子4を成長促進を提供することが可能です。さらに、彼らは怪我5部位で脱髄軸索をmyelinate。
しかし移植後、シュワン細胞は、インプラントのサイトから移行しないと、ホストアストロ6,7と混合しないでください。シュワン細胞とアストロサイトとの間の鋭い境界の形成にこの結果、近位および遠位宿主組織に移植バックを終了しようとして成長する軸索のための障害物を作成する。シュワン細胞と接触するアストロサイトはまた、肥大とアップレギュレーション阻害分子8-13を受ける。
in vitroアッセイモデルシュワン細胞-アストロサイト相互作用するために使用されており、細胞挙動の根底にあるメカニズムを理解する上で重要な役割を演じてきた。
in vitroアッセイこれらは、共培養は、2つのセルの前線を分離するだけの小さなギャップと異なる地域を占める各セルのタイプと二つの異なる細胞を用いて作られている境界のアッセイを、含まれています。細胞が分裂と移行するように、2つの細胞の前線が近づくごとに、他に取得し、最終的に衝突する。これは2つの細胞集団の振る舞いが境界で分析することができます。同技術のもう一つの変化は、文化の2つの細胞集団を混合し、時間をかけて2種類の細胞型は、シュワン細胞と分離するとともに、複数のシュワン-アストロサイトの境界を作成するアストロサイトとの間の島々として一緒に凝集することです。
2種類の細胞型の相互作用を研究に使用される第二のアッセイは、細胞の動きが他の細胞型単層14,15の表面に追跡することができます遊走アッセイです。このアッセイは、一般的に反転したカバースリップのアッセイとして知られています。シュワン細胞は、小さなガラスの破片上で培養され、それらは、アストロサイト単分子膜の表面に顔を下に反転していると、移行はカバースリップの端から評価される。
両方のアッセイは、細胞の排除と境界形成に関与する根本的なメカニズムの研究に尽力されている。これらの手法を用いて同定された分子の一部はN -カドヘリン15、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPGs）16,17、FGF /ヘパリン18、エペソ/エフリン19を含む。
この記事では、段階的に境界の分析および移行のアッセイを記述すると発生する可能性のある技術的な問題を解明していきます。
プロトコル
1。境界アッセイ：
- 基本的な準備：チャンバースライドは、ポリ- D -リジン一晩滅菌ガラススライドでコーティングされている実験を開始する前に用意されています。培地は10％ウシ胎児血清（FCS）、および1％ペニシリン - ストレプトマイシン- Fungizon（PSF）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いて調製される。また、カルシウム/マグネシウムフリーハンクス平衡塩溶液（HBSS）のボトルが用意されています。
- フラスコで培養したラット初代シュワン細胞は、0.1％トリプシンを用いて3分間トリプシン処理されています。初代ラットアストロサイトの培養は、0.1％トリプシンを用いて5分間トリプシン処理しています。
トリプシンは、DMEMを加えると10％FCS、1％PSFを補充によってinactivedている。 - トリプシン処理シュワン細胞と星状膠細胞を15mLファルコンチューブを分離するために移し、5分間300Gで遠心分離されています。
- シュワン細胞とアストロサイトは2 × 10 6（細胞密度の変動のための代表的な結果のセクションを参照）の密度で再懸濁する。
- シュワン細胞懸濁液50μLの低下は、PDLコーティングチャンバースライドの井戸の一端に配置されます。ガラスのストリップは、チャンバの中心に向かって降下はストレートエッジを生成するためにスメアするために使用された。 （ガラスカッターを使用して、長方形のガラス製カバースリップは、それが境界のアッセイに使用されるチャンバースライドの幅に収まるだろうと縦方向にようにカットされます）
- アストロサイトの懸濁液50μLの番目のドロップは同じ井戸の反対側の端に置かれ、それらの間の小さな0.2ミリメートルのギャップを持つ最初のドロップ塗抹標本に平行なエッジを作成するために中心に向かって塗抹した。
- チャンバーは、ドロップが2時間37℃のインキュベーター内に置かれている含まれているスライド。
- 2時間後、培養物を、非添付の細胞残渣およびDMEM / 10％PSFが追加さFCS / 1％を含む新鮮な培地を除去するDMEMで洗浄した。
注：DMEM / 10％FCS / 1％PSFは、シュワン細胞の増殖を刺激するフォルスコリン（2μmの）とウシ下垂体抽出物（BPE）（10μgの/ mL）で補足することができます。 BPEは、長期的なシュワン細胞の培養を可能にするために必要な成長因子を供給し、フォルスコリンは、細胞増殖を誘導するシュワン細胞内サイクリックアデノシン一リン酸のレベルを発生させます - 細胞を37 ° C、7％CO 2インキュベーターで約8-10日間培養されています。培地は3日ごとに変更する必要があります。つのセルの前線は、最終的にお互いに達し、鋭い境界は、2種類の細胞型との間で形成されます。この段階での実験は、境界形成に関与する因子を分析を行うことができます。
- 共培養は4％ホルムアルデヒドとシュワン細胞を用いて固定することができる共培養中の細胞を識別するために、抗GFAP抗体と抗P75抗体およびアストロサイトを用いて免疫染色することができます。 P75抗体は、アストロサイトは欠いているシュワン細胞上の低親和性NGF受容体を認識する。抗GFAP抗体は、アストロサイトの細胞質に局在するグリアfirbrillary酸性タンパク質を認識する。 （代表的な境界については、図1Aを参照してください）
2。マイグレーションアッセイ：
- 4ウェルプレートには、（15mm厚井戸）アストロサイト単分子膜を作成するためのPDLコーティング晩と準備です。
- 一次星状膠細胞培養は、0.1％トリプシンを用いて5分間トリプシン処理しています。トリプシンは、DMEM、10％FCS、1％PSFと5分間300Gで遠心分離し細胞を添加した添加することにより不活化される。 （図2を参照）
- アストロサイトは、1 × 10 5細胞/ mLで再懸濁する。この溶液1mlは、4ウェルプレートの各ウェルPDLコートされたに追加されます。単分子層が完全にコンフルエントになるまで、アストロサイトは、24〜48時間培養する。
- アストロサイト単分子層の作成と平行状細胞単層上のシュワン細胞の遊走を、評価するために、円形のPDLコートされたガラス製カバースリップを50 mLのチューブに入れ、ガラスの小さな断片を作成するためにプラスチック製のピペットを用いて粉砕されています。
- ガラスの破片を6ウェルプレートの皿にウェルに移し、ピンセット、適切なサイズのフラグメントを使用して選択し、他のウェルに配置されている。 5ガラスの破片を6ウェルプレートの各ウェルに配置されます。
- フラスコで培養した主なシュワン細胞は、0.1％トリプシンを用いて3分間トリプシン処理されています。トリプシン処理シュワン細胞を15 mlのFalconチューブを分離するために移し、5分間300gで遠心分離されています。シュワン細胞は、DMEM/10％FCS / 1％PSFで2倍に10 6細胞/ mLに再懸濁されている。
- シュワン細胞懸濁液20μL滴を6ウェルプレートとセルに入れ、各5カバーガラスの破片で37インキュベートしている° C、7％CO 2で2時間かけて添加される。
- 2時間後、シュワン細胞は、カバーガラスの破片とDMEM/10％FCS / 1％PSF（BPEのフォルスコリン及び10μgの/ mLの2μmのがそれぞれに追加されるもので、断片が完全に培地に覆われていることを補足した）に接続されている。
- ガラスの破片が完全にCONになるまでの断片を含む6ウェルプレートは、24〜48時間インキュベーター内に配置されていますシュワン細胞と流暢。
- 一度フラグメントはシュワン細胞でコンフルエントの、各断片は、慎重に鋭いピンセットを使って拾い、アストロサイトの単分子層への面を下に反転してアタッチされていない細胞を除去し、HBSS浸漬される。
- 各ウェルは、FCS / 1％PSFとシュワン細胞は24から48までの期間のために移行するために許可されているDMEM/10％1mLで覆われている。この期間中にそのような増殖因子として実験的な試薬は、シュワン細胞の遊走の数と距離に与える影響を評価するために追加することができます。
- 移行期間に続いて、ガラスの破片は30分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）を追加することにより、各ウェルの底部に固定されています。固定に続いて、P75（低親和性NGF受容体を認識する）ためのシュワン細胞を免疫染色し、それらを光学顕微鏡下でシュワン細胞の可視化を可能にするためにABCストレパビジンキット - ジアミノベンジジン（DAB）を、使用して染色。
3。代表的な結果：
8-10日以下のシュワン-アストロサイト共培養は、2種類の細胞型との間の鋭い境界を示す。シュワン細胞の増殖が増強されるフォルスコリンおよびBPEは、培養に使用されている場合、この境界はより顕著です。
は境界が10日間の期間中に観察されていない場合の境界が確立されるまで、文化の時間がさらに増加することができます。細胞密度の比を変更すると、境界形成を増加させる別の方法です。 3時01分シュワンの比率：細胞懸濁液8,18を準備する際にアストロサイトの細胞密度を使用することができます。
ラインを混ざりセルを評価するために、シュワン細胞やアストロサイトを識別するには、以下の免疫染色は、境界が確立されており、アストロサイトの領域に移行するシュワン細胞の数を蛍光顕微鏡下でカウントすることができますどこに描画することができます。
下の画像取得の境界、整形式のシュワン細胞とアストロサイトの分離（図1A）と細胞が悪い手法（図1B）のためにも別の地域に分離していないものと、持たないものの2つの例を示します。
図1境界アッセイ：シュワン-アストロサイト相互作用。シュワン細胞の増殖を刺激するフォルスコリンとBPEの存在下でA）10日間共培養アッセイは、2種類の細胞（赤= P75、緑= GFAP）との間の鋭い境界を示しています。 B）境界が形成されていない10日間共培養アッセイおよび二つの細胞の前線が混在。 （赤= P75、緑= GFAP）の境界の準備中に隣同士に星状膠細胞とシュワン細胞の液滴を配置しながら、これは2つの液滴の混合することによるものです。
図2。コンフルエントアストロ単層の代表画像
マイグレーションアッセイは、別の細胞型の表面上で1つの細胞型の動きを評価するため、境界の形成とは異なる現象を評価する。
練習は単分子膜上にカバースリップが鋭い鉗子によるシュワン細胞に覆われたガラスの破片やアストロサイト単層に損傷が発生するしない反転確保するために必要とされる。シュワン細胞の遊走を評価するために、移行の最大距離とカバースリップの端から移行する細胞の数を光学顕微鏡下で測定することができます。
下記のアストロサイト単分子層の表面（図3）にDAB染色を用いてP75抗体で染色されたシュワン細胞のイメージがあります。
逆カバースリップのアッセイを用いて図3。移行アッセイ。 A）シュワン細胞（茶色、P75抗体で免疫染色）カバースリップの端から離れて移行。離れてカバースリップから細胞移動の方向に矢印が。
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ディスカッション
上記のアッセイは、シュワン-アストロサイトとアストロサイトの環境に限定されたシュワン細胞の遊走との間の境界形成に関与する複数の要因の役割を示す様々な研究で使われてきました。
それは戦略の開発を最適化できると移植後のシュワン細胞移植の統合を強化し、そうすることで可能に宿主組織に移植片の背面からの再生軸索の出口を促進するとして、これらのイベントの根底にあるメカニズムを理解することは不可欠であるコネクションの形成宿主組織を持つ。
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
我々は彼女の親切な助けのためにリッパウォーレンに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 41966-029 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-088 | |
| FCS | Invitrogen | 10091-148 | |
| PSF | Invitrogen | 15240-062 | |
| BPE | Invitrogen | 13028-014 | |
| フォルスコリン | Calbiochem | 344273 | |
| カバーガラス | VWR international | 631-0149 | |
| カバーガラス（長方形） | Menzel-Glaser | BB022050A1 | |
| チャンバースライド | Nalge Nunc international | 177380 | |
| 4ウェルプレート、6ウェルプレート | Nalge Nunc international | 4ウェルプレート6ウェルプレート | |
| ラットp75抗体 | EMD Millipore | MAB365 | |
| GFAP抗体 | Dako | Z0334 | |
| 二次抗体（Alexa結合） | Invitrogen | A-11004 A-11034 | ヤギ抗マウス 568ヤギ抗ウサギ 488 |
| 二次抗体（ビオチン標識） | Vector Laboratories | ヤギ抗マウス | |
| DABタブレット | Sigma-Aldrich | D4418 | |
| ABC eliteキット | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| 精密ピンセット | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| パラホルムアルデヒド | Sigma-Aldrich | P6168 | |
| Fluorosave | Calbiochem | 345789 |
参考文献
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