のUV -誘発複製中間体の可視化 E.大腸菌二次元アガロースゲル分析を用いた

Summary

我々は、2次元アガロースゲル分析は、UV照射後に発生する複製の中間体の構造を識別するために使用できるようにするための手順を示します。

Abstract

DNA損傷の存在下で不正確な複製は、すべての細胞型で観察し、広く直接ヒトの癌の開発に関連付けられていると信じられている細胞の再配列と特異的変異の大部分を担当しています。このような紫外線照射によって誘導されるようなDNA損傷は、著しく正確にゲノムテンプレートを複製する複製の能力を損なう。遺伝子産物の数は、複製が鋳型にDNA損傷を検出すると、必要とされるが確認されている。しかし、残りの課題は、これらのタンパク質は、複製中に病変の処理方法を決定することでした

Protocol

1。成長とUV照射。

1. 0.4％グルコース、0.2％カザミノ酸、および10μg/ mlのチミン（DGCthy媒体）と100μg/ mlのアンピシリンを補充デイビス培地¹で栽培プラスミドpBR322を含有する新鮮な一晩培養液200μlのはペレットです。細胞ペレットを、アンピシリンを欠く200μlのDGCthy培地に再懸濁し、DGCthy培地20 mlに接種するために使用されます。
2. 培養物は、0.5のOD _600（〜5 × 10 ⁸細胞/ ml）に37℃振盪培養器でアンピシリン選択° Cなしで栽培されています。アンピシリンのない成長は、いくつかの変異体で発生する可能性がある異常なまたは非生産的な複製の中間体に対する選択を回避することができます。損傷を誘導するためにUV光を使用している場合は、UVの効果的な投与量を減らすこと、これらの波長とシールド細胞で強く吸収するので、さらに、、メディアからのアンピシリンの除去が必要です。
3. 黄色のライトの下で作業し、培養は、攪拌用の回転台に15センチメートル直径のシャーレに入れられます。私たちの文化は、UVC光度計を用いて測定される〜1 J/m2/sec、の照射線量率を生成する15ワット殺菌灯からの距離に配置されています。文化は、50 J/m2を照射して、バックにすぐに配置され、実験期間中は37℃のインキュベーターを振る。この投与量は平均、1シクロブタン型ピリミジン二量体ssDN....

Discussion

紫外線による損傷の存在下および非存在下で野生型の細胞から得られた典型的な結果を図1に示されています。細胞が急速に指数増殖期で成長しているときに損傷がない場合には、合計プラスミドDNAの〜1％がYの円弧で見つけることができます。ブロックされた複製フォークが損傷部位に蓄積するように照射後、Y字型の分子の一過性増加が観察される。 X字型の複製中間体はまた、一時的に蓄積され、病変が修復されるとと相関する時間まで持続します。

サザン解析の代わりに、複製の中間体は、精製された、プラスチック製のストローでゲルからパンチすることができ、電子顕微鏡で直接観察。我々は、DNA損傷が発生した複製フォークを処理するために、これらの変異体に蓄積する異常な複製の中間体を識別するために必要な遺伝子産物を同定するために正常にこのアプローチを使用している。さらに、このアプローチは、簡単にDNA損傷の他の形態を検討するように変更することができます。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
GE	Healthcare	G15T8	Yellow Lighting
15 μワット殺菌ランプ	シルバニア	F20T12/GO	UV ランプ
ブラックレイ UV 強度計 254nm	ダイガー	EF28195T	UVC 光度計
0.025 μm ポアディスク	Whatman, GE Healthcare	VSWP04700	フローティング透析ディスク
PvuII	Fermentas	ER0632	制限 エンドヌクレアーゼ
ニックトランスレーションキット	ロシュ グループ	976776	32P標識プローブを作るには
ブロッティングペーパー	Whatman, GE Healthcare	3030-704	南向き転写
用 ナイロン膜	GE ヘルスケア	RPN203S	サザントランスファーの場合