のUV -誘発複製中間体の可視化 E.大腸菌二次元アガロースゲル分析を用いた

サマリー

我々は、2次元アガロースゲル分析は、UV照射後に発生する複製の中間体の構造を識別するために使用できるようにするための手順を示します。

要約

DNA損傷の存在下で不正確な複製は、すべての細胞型で観察し、広く直接ヒトの癌の開発に関連付けられていると信じられている細胞の再配列と特異的変異の大部分を担当しています。このような紫外線照射によって誘導されるようなDNA損傷は、著しく正確にゲノムテンプレートを複製する複製の能力を損なう。遺伝子産物の数は、複製が鋳型にDNA損傷を検出すると、必要とされるが確認されている。しかし、残りの課題は、これらのタンパク質は、複製中に病変の処理方法を決定することでした

プロトコル

1。成長とUV照射。

1. 0.4％グルコース、0.2％カザミノ酸、および10μg/ mlのチミン（DGCthy媒体）と100μg/ mlのアンピシリンを補充デイビス培地¹で栽培プラスミドpBR322を含有する新鮮な一晩培養液200μlのはペレットです。細胞ペレットを、アンピシリンを欠く200μlのDGCthy培地に再懸濁し、DGCthy培地20 mlに接種するために使用されます。
2. 培養物は、0.5のOD _600（〜5 × 10 ⁸細胞/ ml）に37℃振盪培養器でアンピシリン選択° Cなしで栽培されています。アンピシリンのない成長は、いくつかの変異体で発生する可能性がある異常なまたは非生産的な複製の中間体に対する選択を回避することができます。損傷を誘導するためにUV光を使用している場合は、UVの効果的な投与量を減らすこと、これらの波長とシールド細胞で強く吸収するので、さらに、、メディアからのアンピシリンの除去が必要です。
3. 黄色のライトの下で作業し、培養は、攪拌用の回転台に15センチメートル直径のシャーレに入れられます。私たちの文化は、UVC光度計を用いて測定される〜1 J/m2/sec、の照射線量率を生成する15ワット殺菌灯からの距離に配置されています。文化は、50 J/m2を照射して、バックにすぐに配置され、実験期間中は37℃のインキュベーターを振る。この投与量は平均、1シクロブタン型ピリミジン二量体ssDNAのすべての4.5キロバイトで、生成します。黄色の照明は、光回復酵素によるシクロブタンのピリミジンダイマーの光回復反転を防ぎます。

2。 DNAの分離。

1. 複製の中間体が検査される時期に、文化の0.75 mlのアリコートを0.75 mlの氷冷NET30バッファー（100mMのNaCl、10mMのトリス、pH8.0、30mMのEDTA）に入れているとの終わりまで、氷上に置いた時間経過。我々は通常は0で検査試料、15、30、45、60、および90分で、90分の時間経過を実行する。 EDTAと冷たい温度を効果的に複製とヌクレオチド除去修復を停止するのに役立つ。
2. 各サンプルは1.5 mg / mlのリゾチームとTEは0.2 mg / mlのRNaseA（10 mMトリス、pH 8.0、1mMのEDTA）150μlの中に再懸濁し、そして20分間37℃で溶解し、その後ペレットです。この時点で、20％のサルコシルのプロテイナーゼK（10mg/ml）と10μlのの10μlを添加し、そのインキュベーションは1時間継続して許可されます。プロテイナーゼKおよびサルコシルは、フェノール抽出が発生する前に、細胞膜やタンパク質に関連するかもしれないDNA断片を解放するのに役立ちます。積極的に複製するDNAは、しばしばタンパク質や細胞膜複合体にバインドされているので、これは回収されているレプリケーションフラグメントの収量を高めることができます。
3. 次に、試料を各試料にフェノールの2容量を追加することによって抽出され、チューブを穏やかに5分間反転されています。その後、クロロホルム/イソアミルアルコール（24 / 1）の2容量を加え、このチューブを穏やかに5分間再び反転している。
4. サンプルは、5分間微量遠心機で14,000 rpmで遠心分離し、各サンプルの上部の水相を除去し、新しいチューブに入れ。その後、クロロホルム/イソアミルアルコール（24 / 1）の4倍量を添加し、チューブを穏やかに5分間反転させ、5分間14,000 rpmで再び遠心分離されています。
5. 各サンプルの最上位、次いで水相をビーカーに0.1 × TEを250mlに浮かぶ47ミリメートルワットマン0.025μmの細孔、ディスク上の各サンプル100μLをスポッティングして1時間透析する。一本鎖領域または分岐点で複製構造はせん断の影響を受けやすいので、一般的に口を広げてとせん断力を最小限に抑えるためにカミソリの刃で私たちのピペットチップを切断。 DNAを制限酵素で消化されるまで、一般的には、ピペッティングは最小限に抑える必要があります。
6. 各サンプルは、複製起点からすぐ下流プラスミドを線形化をPvuII（New England Biolabs）で消化する。
7. 前のアガロースゲル、100μlのクロロホルムとブロモフェノールブルーとキシレンシアノールを含む6Xローディング色素の20μlので読み込むために、各サンプルに添加し、混合されています。その後、ローディング色素を含有する水相の40μlのは、ゲルにロードされます。構造的バイアス、構造的なアーティファクト、およびDNAのせん断を最小限に抑えるために、この分離手順では、細胞溶解に続く一本鎖領域、沈殿、またはDNAサンプルを濃縮するために豊かにするすべての手順が含まれていません。

3。 2Dゲルおよびサザン分析。

1. 2次元アガロースゲル分析は、3から変更されます。 1次元の場合は、制限されたDNAサンプルが1V/cmで1X TBEは0.4％アガロースゲルを介して実行されています。 10X TBEストック溶液の1リットルは含まれています：
   • 108グラムトリスベース
   • 55グラムのホウ酸
   • 40ミリリットル0.5M EDTA（pH 8.0）を
2. ラムダのHind IIIサイズマーカーが最初のレーンにロードされ、その後、サンプルはすべての他のレーンにロードされます。我々は通常、最初のDを実行するimension〜12月15日時間。車線をスキップすることが容易番目の次元にキャストする車線をスライスすることができます。低電圧および低％のアガロースゲルは、主にサイズに基づいてDNA断片を分離するのに役立つ。
3. 二次元の場合は、ゲルのレーンは大型肉屋のナイフを使用して、最初の次元ゲルから切り出しています。ラムダのHind IIIマーカーを含む最初の車線は、エチジウムブロマイドで染色することができます。ガイド、作物としてのラムダをHind IIIマーカーを使用し、直鎖状プラスミドの実行を想定している場所の下であるゲルの領域を破棄する。これらの条件下では、我々は、線形化されたpBR322には若干キシレンシアノールの上に汚れを実行すること。見つける
4. 番目の次元をキャストするには、各レーンは、空のゲルキャスターの上部に水平に配置されます。 1X TBE中の1.0％アガロース溶液を55℃に調製し、そして冷却されるこの時、ゲル溶液が完全にゲルスライスをカバーすることを確認し、番目の次元をキャストするために注がれています。ゲルがセットされると、それはバッファが循環することができる電気泳動装置で6.5V/cmで実行されます。我々は通常、二次元目〜5.5から7時間を実行する。高電圧と高いパーセントアガロースゲルは、効果的にDNAをその形状に基づいてフラグメントだけでなく、大きさを分離。非線形の形状は、二次元目を通して、より実行速度が遅く。
5. 以下の電気泳動は、ゲルは、H ₂ Oですすぎ、15分間0.25M塩酸の400ミリリットルで2回洗浄し、H ₂ Oをリンスしている、、、その後30分間400ミリリットル0.4MのNaOHで2回洗浄。酸は、より効率的に転送する小さな断片に部分的に刻み目にDNA分子を提供洗う。このステップでは、原因で大きなサイズとDNA複製の中間体のユニークな形に必要です。
6. ゲル中のDNAをハイボンドN +ナイロンメンブレン⁴に転送されます。我々は、0.4M NaOHで下向きのアルカリトランスファーシステムを使用してください。簡単に言えば、0.4M NaOHに浸したブロッティングペーパーの2枚の紙タオルの大規模なスタックに置かれます。ナイロンメンブレンは、0.4M NaOHに浸漬し、吸い取り紙の上に配置されます。次いでゲルを注意深くNaOH溶液で湿らせたブロッティング紙の別の部分、続いて、これの上に階層化されています。最後に、接液吸い取り紙の長い作品は、上部に階層化され、その両端を芯として機能するように0.4M NaOH溶液の1リットルを含む皿に置かれます。我々は通常、6〜12時間のためのDNAの転送をしましょう​​。
7. ナイロン膜が除去され、5 × SSC緩衝液で20〜30秒を洗浄し、そして10.5ミリリットルプレハイブリダイゼーション溶液を含むハイブリダイゼーションのローラーボトルに入れ。その後、メンブレンを42℃以上6時間のための回転と℃でインキュベートする。プレハイブリダイゼーション溶液：
   • 5.0ミリリットルホルムアミド
   • 0.5ミリリットル20％SDS
   • 2.5ミリリットル20X SSCの*
   • 2.0ミリリットル50Xデンハルト*
   • 0.5 mlのサケ精子DNA（10mg/ml）
     SSCおよびデンハート用*レシピは5に記載されています
8. プレハイブリダイゼーションの期間中、pBR322プラスミド1μgを[32 P] - dCTPで標識したαを使用してロシュから提供されたプロトコルに従ってニックトランスレーションにより32 Pで標識されている。放射性標識プローブ（100μL）●スクリューキャップのマイクロ遠心チューブに10分間98℃インキュベートして変性させ、その後、氷上に即座に配置されます。
9. 変性したプローブが含まれている5.9ミリリットルのハイブリダイゼーション溶液に追加されます。
   • 3.0ミリリットルホルムアミド
   • 1.5ミリリットルSSC
   • 1.0ミリリットルH ₂ O
   • 0.15ミリリットル50Xデンハルト
   • 0.10ミリリットル20％SDS
   • 0.15ミリリットル10mg/mlサケ精子DNA
10. プレハイブリダイゼーション溶液は、ローラーボトルから注がれており、ハイブリダイゼーション溶液は、ローラーボトルがその後12時間以上42℃のインキュベーターと回転に返されるインチ注がれています。
11. ハイブリダイゼーション溶液は、ローラーボトルから注がれる。次に、ブロットは、回転で0.5X SSC、42℃で0.1％SDS ° Cを含む洗浄溶液の〜150 mlのローラーボトルで20分間4回洗浄される。
12. 液体が目に見えて消失するまで最後の洗浄の後、メンブレンをペーパータオル上に配置されます。膜は、その後、ポリ塩化ビニールのプラスチックラップで包み、phosphorimager画面に公開されます。我々はストーム840とその関連ImageQuantソフトウェアを用いて放射能を視覚化し、定量化する。

4。代表的な結果：

図1。プラスミド複製の中間体は、紫外線誘発DNA損傷の存在下および不在下で観察。2D -アガロースゲル分析によって観測されたプラスミドpBR322を消化PvuIIでの移行パターンを図示しています。非複製リニアプラスミドは線形4.4 - kb断片として実行されます。複製プラスミドは、彼らの大規模化、無に起因する非複製のフラグメントよりも遅く移行Y字型構造を形成nlinear形状。この移行のパターンはよく向かって線形領域から伸びる弧を形成している。以下のUV照射、ダブルYまたはX字型の分子は、Y字型の分子の弧よりもゆっくりと移行する円錐領域で観察される。 2DゲルpBR322に32P標識したプローブのサザン解析の例は、すぐにUV照射し、UV照射後15分（出版社から許可を得て複製した）後の細胞のために示されています。

ディスカッション

紫外線による損傷の存在下および非存在下で野生型の細胞から得られた典型的な結果を図1に示されています。細胞が急速に指数増殖期で成長しているときに損傷がない場合には、合計プラスミドDNAの〜1％がYの円弧で見つけることができます。ブロックされた複製フォークが損傷部位に蓄積するように照射後、Y字型の分子の一過性増加が観察される。 X字型の複製中間体はまた、一時的に蓄積され、病変が修復されるとと相関する時間まで持続します。

サザン解析の代わりに、複製の中間体は、精製された、プラスチック製のストローでゲルからパンチすることができ、電子顕微鏡で直接観察。我々は、DNA損傷が発生した複製フォークを処理するために、これらの変異体に蓄積する異常な複製の中間体を識別するために必要な遺伝子産物を同定するために正常にこのアプローチを使用している。さらに、このアプローチは、簡単にDNA損傷の他の形態を検討するように変更することができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
プローブを用いた2Dゲルのサザン解析例	GE Healthcare	G15T8	Yellow Lighting
15 μwatt 殺菌ランプ	Sylvania	F20T12/GO	UVランプ
Blak-Ray UV強度計 254nm	Daigger	EF28195T	UVCフォトメーター
0.025 μm ポアディスク	Whatman, GE Healthcare	VSWP04700	フローティング透析ディスク
PvuII	Fermentas	ER0632	制限エンドヌクレアーゼ
ニックトランスレーションキット	Roche Group	976776	32P標識プローブ作成用
ブロッティングペーパー	Whatman, GE Healthcare	3030-704	サザン転写用
ナイロンメンブレン	GE Healthcare	RPN203S	サザン転写用