方法論記事

大規模ゼブラフィッシュベース in vivoで小分子スクリーン

DOI：

10.3791/2243

⸱

2010年12月30日

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1Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Institute of Chemical Biology, Vanderbilt University School of Medicine, 4Research Medicine, Veterans Affairs TVHS, Vanderbilt University School of Medicine

この記事について

サマリー

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ゼブラフィッシュは、強力なとして浮上している in vivoでプラットフォーム。ここで、我々は、ゼブラフィッシュ胚を用いた小分子の大規模スクリーニングのためのシンプルで実用的な方法を示しています。

要約

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彼らの小さな胚の大​​きさ、急速な発展、透明性、繁殖力、そして哺乳類に多数の分子、形態学的および生理学的類似性を考えると、ゼブラフィッシュは、強力なとして浮上している

プロトコル

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1）ゼブラフィッシュの卵コレクション

  1. 前化学画面の日に午後に、10〜20ゼブラフィッシュの繁殖タンクを設置。水産養殖システムから水を各タンクを埋める。魚のネットを使用して、それぞれの繁殖水槽の内側の容器に大人一人の男性と一から二成人女性を転送する。分圧器を使用して、お互いからオスとメスの魚を区切ります。ケージにラベルを付け、それらの上に蓋をする。
  2. 画面の朝に、繁殖タンクから仕切りを削除し、チームメイトへのゼブラフィッシュができます。次の1時間のコースで、受精卵がそれぞれ内側の容器の下部にグリッドフォールスルーすることができます。
  3. 1時間後、、永久的な貯蔵タンクに大人のゼブラフィッシュを戻す内側のコンテナを削除し、プラスチック製の茶こしを通して各飼育槽内の水に負担をかけることにより卵を集める。
  4. ペトリ皿上のストレーナーを反転し、E3培地を含む洗浄瓶を使用してペトリ皿に卵をフラッシュするように優しくストレーナーをすすいでください。
  5. 不透明な表示されるすべての未受精卵は、、使い捨てのプラスチック製のピペットを使用して削除する必要があります。各交配のクロスは、約200胚が得られるはず。

2）96ウェルプレートで胚をアレー

  1. ガラスパスツールピペットを用いて96ウェルプレートの各ウェルにE3培地で5胚についての転送。
  2. 穿刺に胚を気にしないながら、ピペット - 一度胚は同じくらいの12チャンネル（300μL30）を用いて井戸の可能な外としてE3培地のを削除し、96ウェルプレートに配列される。 12チャンネルピペットを使用して、そのような胚が干上がることがないようにしても、できるだけ早く各0.5μg/mlカナマイシンを含むE3培地250μLを提供。
  3. 化合物を添加するときに必要な段階に達するまで、28.5 ° Cのインキュベーターに96 - ウェルプレートを置く。

3）小分子ライブラリーの移転は、

化合物の転送がロボットの転送方法を自動化することができますが、我々は、手動転送方法を説明します。

  1. 小分子ライブラリーは、典型的には10 mMストックとしてDMSOに格納された各化合物を、96ウェルフォーマットで供給されます。化合物が追加されるときに胚がステージに到達する約60分前に、小分子のアリコート（ソースプレート）を含む96ウェルプレートの希望番号を解凍。ソースプレートのシリアルまたはその他の識別番号をメモしておいてください。プレート上の結露を最小限に抑えるために、融解はDRIERITEを（ワシントン州ハモンドDRIERITE CO、セニア、オハイオ州）を含む乾燥室内で発生する可能性があります。
  2. 簡単に言うと、マルチウェルプレートアダプタを搭載した卓上型遠心機のプレートをスピンダウン。
  3. ソースプレートからアルミシールテープを取り外します。 12チャンネルピペットを使用して、0.5mMの濃度（例えば、10mmの株式250 NLのアリコートで始まる場合、各ウェルにDMSO 4.75μLを加える）にソースプレート内の化合物を希釈する。
  4. 96ウェルプレート（受信者のプレート）の胚は、含まれている受信者のプレートにソースプレートから化合物（0.5）の2.5μLを転送するために、12チャンネル（2-20μL）ピペットを使用して、必要な段階に到達したとき胚。
  5. レシピエント胚のプレート上にソースプレートの識別番号を記録します。今蓋つきの胚と化合物を含む受信者のプレートをカバーし、穏やかに穏やかに渦巻くことでプレートを混合し、28.5 ° Cのインキュベーターに置いてください。
  6. 長期保存のため-80℃の冷凍庫にアルミシールテープと場所で使用されていない小分子（0.5 mm）を含む各ソースプレートをカバーしています。

表現型の目視検査による低分子の効果4）スクリーニング

  1. 画面を実行する前に、"ヒット"を構成するであろう何のために特定の基準を策定する。
  2. 開発の目的の時間に、インキュベーターから化合物で処理した胚を含む96ウェルプレートを取り出して、実体顕微鏡下で各ウェルを調べます。このような循環パターンの変化などの微妙な変化、のよりよい視覚化のために、位相差倒立顕微鏡を使用することができます。蛍光顕微鏡は、組織特異的プロモーター下にGFPまたはDsRedタンパク質の発現の摂動を調べるために使用することができます。
  3. すぐに5胚の内少なくとも3つの任意ウェルの96ウェルプレートは、所定の"ヒット"表現型を示すスキャンします。プレートの識別と各潜在的なヒットのも場所を記録します。
  4. いくつかの投与量（1μMの、5μmの、10μMおよび50μM）における化合物の効果を再検査することにより、潜在的なヒットを再確認する。各用量については、10胚を48ウェルプレートフォーマットでのE3メディアの0.5mlにテストされています。再試験のための化合物の添加時期は、オリジナルのスクリーニングのと同じである必要があります。引き出した表現型がcompounの再検査で再現されたときにヒットが確認されD
  5. 化学ライブラリー内の小分子のデータベースからヒット化合物を識別する。

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ディスカッション

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ゼブラフィッシュベースの化学スクリーンを計画する場合は、特に注意が検討中の表現型とそのような表現型のバックグラウンドレートの堅牢性に注意する必要があります。これは、誘導表現型の化学的抑制のためのスクリーンのために特に重要です。例えば、導入遺伝子の熱ショック誘導による表現型のため、表現型を誘導する条件は、再現性良く正確に容認できないほど高い偽陽性率を避けるために画面を開始する前からマップする必要があります。綿密な計画で、ささやかな設備投資を必要とゼブラフィッシュの化学物質の画面では、細胞シグナル伝達および生理学の新たな変調器の発見につながるだけでなく、ヒト疾患のモデルを反転させる化合物を導くことができる。最後に、古典的な前進遺伝子スクリーニングの類推によって、ゼブラフィッシュベースの化学物質の画面では、基本的な生物学的プロセスの化学遺伝学的解剖のために役立つことがあります。

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開示事項

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利害の衝突は宣言されません。

材料

  1. 目的の遺伝子型の大人のゼブラフィッシュの20組の最小値。
  2. 取り外し可能なインナーコンテナと仕切り（水生生息地）と魚網、繁殖タンク、。
  3. ペトリ皿（10センチ）。
  4. プラスチック製の茶こし。
  5. ボトルcontaing胚の水を洗浄してください。
  6. 使い捨てポリエチレン転送ピペット。
  7. ポリスチレン96穴丸底アッセイプレート（コーニングCOSTAR、ローウェル、マサチューセッツ州）。
  8. ガラスパスツールピペット（フィッシャーサイエンティフィック）。
  9. 手動ピペットポンプ、10 mLの（ベルアート製品、ペクアノック、NJ）。
  10. E3胚の培地：0.003％PTUを（フェニルチオ-カルバミド、シグマ、セントルイス、MO）を含有する5 mMのNaCl、0.17 mMの塩化カリウム、0.33 mMのCaCl 2を 、0.33 mMのMgSO 4を 、。 PTUは、E3胚の培地1 Lに0.3 - gオプションPTUを溶解することにより10倍の溶液として調製することができます。 PTUを含む溶液をアルミホイルで覆うことにより、光から保護する必要があります。
  11. 12チャンネルピペット、20から20μL（エッペンドルフ）。
  12. 12チャンネルピペット、300〜300μL（エッペンドルフ）。
  13. 使い捨てポリスチレンピペット流域、50 mLの（フィッシャーサイエンティフィック）。
  14. DMSO中の10mMストックで96 - WLL形式に配列された構造的に多様な化合物の小分子ライブラリ。各マスタープレートは96ウェルポリプロピレンストレージプレート（コーニング）に分注し、-80℃で使用時まで保存されます。
  15. 96ウェルプレート（Nunc、ロチェスター、ニューヨーク州）のためのアルミシールテープ。
  16. DMSO（シグマ、セントルイス、MO）。
  17. 基本的なインキュベーター、28.5 ° C（フィッシャーサイエンティフィック）。
  18. 透過光のベース（ライカマイクロシステムズ、バノックバーン、イリノイ州）と実体顕微鏡。

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bayliss, P. E. Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish. Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).
  2. Burns, C. G. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).
  3. Hao, J. In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors. ACS chemical biology. 5, 245-253 (2010).
  4. Hong, C. C., Peterson, Q. P., Hong, J. Y., Peterson, R. T. Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling. Curr Biol. 16, 1366-1372 (2006).
  5. Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107, 1355-1358 (2003).
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  7. Yu, P. B. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nature chemical biology. 4, 33-41 (2008).
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  9. Stern, H. M. Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant. Nature chemical biology. 1, 366-370 (2005).
  10. Peterson, R. T. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nature biotechnology. 22, 595-599 (2004).

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