方法論記事

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

DOI：

10.3791/2269

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2011年1月10日

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1Department of Energy, Environmental & Chemical Engineering, Washington University in St. Louis, 2Department of Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis, 3Department of Biomedical Engineering and Cardiac Bioelectricity and Arrhythmia Center, Washington University in St. Louis

この記事について

サマリー

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BKチャネルのイオン電流をパッチクランプ技術を使用して記録されます。 BKチャネルはで表されますアフリカツメガエル卵母細胞メッセンジャーRNAを注入することにより。パッチクランプ記録中に細胞内液を灌流システムによって制御されます。

要約

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大コンダクタンス、電圧およびCa 2 +活性化K +（BK）チャネルの活性化を研究するために設計されているプロトコルは、ここで紹介。プロトコルはまた、他のイオンチャネルや神経伝達物質受容体1の構造機能相関を研究するために使用されることがあります。 BKチャネルは、幅広くさまざまな組織で発現され、平滑筋収縮、内有毛細胞の周波数同調と神経伝達物質放出2-6の規制の規制などを含め多くの生理機能に関与している。 BKチャネルは、膜の脱分極によっておよび細胞内Ca 2 +およびMg 2 + 6〜9によって活性化されています。そのため、プロトコルは、膜電位と細胞内液の両方を制御するように設計されています。このプロトコルでは、BKチャネルのメッセンジャーRNAを18℃で10から13のインキュベーションの2-5日間続いてアフリカツメガエル卵母細胞（ステージV - VI）に注入されます。単一または複数のBKチャネルを含む膜のパッチは、パッチクランプ法を10-13を使用してインサイドアウトの構成で切り出しています。パッチの細胞内側は、異なる条件下でのチャネルの活性化を調べることができるように記録する際に必要なソリューションで灌流される。要約すると、BKチャネルのmRNAは卵母細胞膜上のチャネルタンパク質を発現するアフリカツメガエル卵母細胞に注入され、パッチクランプ技術は、制御電圧と細胞内のソリューションの下にチャネルを流れる電流を記録するために使用されます。

プロトコル

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1。卵母細胞へのmRNAの注入

  1. 0.05注入- Nanoject IIオートナノリッターインジェクター（ドラモンドサイエンティフィック社、モデル3-000-204）を使用して、 アフリカツメガエルの卵母細胞（ステージV - VI）にin vitroで転写した50 ngのメッセンジャーRNAを。各mRNAのダースの卵母細胞での注入を繰り返します。
  2. 倍ND - 96ソリューション（96 mMの塩化ナトリウム（NaCl、氏58.44グラム/モル）、2 mMの塩化カリウム（KCl、氏74.56グラム/モル）、1.8 mMの塩化カルシウム（CaCl 2で •2H 2 Oを用いて注入した卵母細胞を洗い流す、氏147.02）、1mMの塩化マグネシウム（MgCl 2の •6H 2 O、ミスター203.31グラム/モル）、5 mMの4 - （2 -ヒドロキシエチル）-1 - piperazineethanesulfonic酸（HEPES、氏238.31グラム/モル）、2.5 mMのピルビン酸ナトリウム（ミスター110.04グラム/モル）、および1xペニシリン - ストレプトマイシン。pH7.6）で、その後2 +の間に18℃で培養プレートとインキュベート中に置いてください。

2。灌流システムの準備

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自動化ValveLink 16灌流システムのイラスト。灌流システムは、灌流チューブを介して、ソリューションの貯水池の灌流液を押し出すために加圧された窒素を使用し、血流の鉛筆、チップに。灌流液の各ストリームの流れは、1つのタンクのバルブの一電子バルブによって制御されます。このプロトコルでは、貯水池の一つは、廃棄物の収集だけでなく、圧力放出機構として加圧や機能ではありません。 （写真は、ベンダーのWebサイトのhttp://www.autom8.comから適応）

  1. 灌流の鉛筆にチューブを接続します。電磁弁コントローラをオンにして、電磁弁を開きます。
  2. チューブと灌流の鉛筆が目詰まりして気泡のないことを保証するために、脱イオン水で満たされた注射器を用いて各チューブを脱イオン水（DI）を押してください。
  3. ソリューションの貯水池にチューブを接続し、加圧された窒素を適用するにはガスボンベのバルブを開きます。
  4. リザーバー溶液とチューブを埋めるためにタンクのバルブを開きます。必要に応じて、溶液中の気泡を除去するためにタンクのバルブをはじく。チューブが液で満たされた後バルブを閉じます。
  5. 水で灌流チップを記入し、血流の鉛筆にそれをねじ込む。先端を接続するときに気泡をトラップしないように注意してください。
  6. 粘土を使ってバスのステージへの血流の鉛筆を修正。灌流チップは、バスのスペースになっていることを確認します。灌流システムは、現在設定されています。
  7. お風呂にDI水を追加。灌流先端が水中にされていることを確認します。
  8. それぞれの灌流液が正しく灌流の先端から出ることをテスト。廃棄物のコレクターのチューブに接続された電子バルブを閉じ、一度に灌流液（140 mMの水酸化カリウム（KOH、バルブを開いてM rは 56.1グラム/モル）、20mMの4 - （2 -ヒドロキシエチル）-1 - piperazineethanesulfonic酸（HEPES、M rは 238.31グラム/モル）、2 mMの塩化カリウム（KCl、M rは 74.56グラム/モル）、1mMのエチレングリコール-ビス（2 - aminoethylether）- N、N、N'、N' -四酢酸（EGTA、M rは 380.35グラム/モル）、pHはメタンスルホン酸（メソ3、M rは 96.1グラム/モル）が7.1から7.2に調整され、 カルシウム 、必要なときに+またはMg 2 +を所望の濃度に追加されます）。顕微鏡下で、血流の先端から出てくる灌流液の噴出を観察。灌流液用バルブを閉じて、廃棄物のコレクターのためのバルブを開きます。血流のジェットはほぼ消えるはずです。すべての灌流液で同じテストを繰り返します。
  9. （2 -ヒドロキシエチル）-1 - piperazineethanesulfonic -あなたが正しく、すべての灌流液の流れを確認したら、浴溶液（140 mMの水酸化カリウム（KOH、M rは 56.1グラム/モル）、20mMの4に風呂にDI水を交換してください酸（HEPES、M rは 238.31グラム/モル）、2 mMの塩化カリウム（KCl、M rは 74.56グラム/モル）、pHをメタンスルホン酸（メソ3、M rは 96.1グラム/モル））によって7.1から7.2に調整されます。

3。パッチクランプ法

  1. 各パッチクランプセッションの前に再塗装塩化銀と銀の記録電極。最初に、ピペットホルダーと水没から少なくとも15分間は新鮮な漂白剤の入ったバイアルに、電極ワイヤの先端の半分を電極線を取り外します。これは、ワイヤ上の塩化銀の層を堆積。
  2. 脱イオン水とブロット乾燥と電極ワイヤをすすぎます。その後ピペットホルダーに戻ってAg / AgCl電極をインストールしてください。
  3. ヘッドステージにバス（参照）電極を接続し、お風呂に入れてください。これは記録用の電極を準備します。
  4. 今すぐデータを取得するための準備。コンピュータの電源をオンにして、コンピュータのプリンタポ​​ートにハードウェアキーを差し込みます。あなたがHEKAパルスであるデータ収集ソフトウェアを、使用するためのハードウェアキーを接続する必要があります。
  5. アンプのスイッチ（アクソンインスツルメンツ、AXOPATCH 200B）とHEKAパルスを開始します。このような刺激の尺度として、プロトコルのファイルをロードし、構成設定を調整します。構成設定を調整するための目標は、テストの潜在的なコマンドの潜在的に正確に等しいことを保証することである。これは、データ収集装置を準備します。
  6. 卵母細胞を準備します。ストリッピング溶液中に浸し卵母細胞（200mMのN -メチル- D -グルカミン（NMG、M rは 195.22グラム/モル）、200mMのアスパラギン酸（無K +）（M rは 133.1グラム/モル）、2 mMの塩化カリウム（KCl 、M rは 74.56グラム/モル）、10mMのエチレングリコール-ビス（2 - aminoethylether）- N、N、N'、N' -四酢酸（EGTA、M rは 380.35グラム/モル）、1mMの塩化マグネシウム（塩化マグネシウム2•6H 2 O、M R 203.31グラム/モル）、10mMの4 - （2 -ヒドロキシエチル）-1 - piperazineethanesulfonic酸（HEPES、M rは 238.31グラム/モル）、pHを水酸化ナトリウム（NaOHにより7.4に調整され5 M R 40.0グラム/モル） - 10分で剥離液により、卵黄膜を除去するなり、細胞膜から卵黄膜を切り離します。
  7. ゆっくりと鉗子の2つのペアを使用して卵母細胞から卵​​黄膜を取り除く。 devitellinized卵母細胞は非常に壊れやすく、そのため必要に応じて少しに移動する必要があります。
  8. 空気や気泡にdevitellinized卵母細胞の接触を避けるために注意しながら、お風呂に卵母細胞を転送するのに十分な溶液で満たされたガラスピペットを使用してください。これは録音のための卵母細胞を準備します。
  9. パッチピペットを準備します。サターP - 97火焔/ブラウンマイクロピペットプラーにガラス毛細管（VWRインターナショナル、カタログ番号53432から921）を挿入した後、ガラスピペットを引き出します。先端の形状と開口部の直径を決定するために顕微鏡下でピペットを守ってください。開口径は2-4マイクロメートルにする必要があります。
  10. 録音中に容量性電流を低減するために、滑らかな先端、コートワックスとの先端を確実にし、それを火 - ポーランド語。
  11. （2 -ヒドロキシエチル）-1 - piperazineethanesulfonic酸（HEPES、M R -ピペット溶液（140 mMの水酸化カリウム（KOH、M rは 56.1グラム/モル）、20mMの4内のピペットの先端を配置することにより、ピペットチップを埋める238.31グラム/モル）、2 mMの塩化カリウム（KCl、M rは 74.56グラム/モル）、2mMの塩化マグネシウム（MgCl 2の •6H 2 O、M R 203.31グラム/モル）、pHはメタンが7.1から7.2に調整され酸（メソ3、M rは 96.1グラム/モル））とプランジャーを描画。これは、先端を濡らす。
  12. ピペット溶液注射器を使用し、Ag / AgCl電極を内側にピペットホルダーにピペットを配置し、ピペット溶液との接触を完全にピペット1 / 3を埋める。これは、パッチピペットを準備します。
  13. 準備卵母細胞から切り出すインサイドアウトパッチをするために、顕微鏡下で卵母細胞の明確なエッジを見つける。マニピュレータを使用して卵母細胞に近いパッチピペットを移動します。ピペットの直列抵抗を記録。パッチピペットの理想的な直列抵抗は、ピペット溶液で満たされたと浴溶液に浸漬MΩ1から1.5の間です。
  14. 抵抗が約2倍になるまで徐々に卵母細胞に対してピペットを押してください。
  15. ギガオームシールが得られるまでピペットホルダーに接続された吸引管を介して口の中で膜に穏やかな吸引を適用します。分のカップルのための電圧-30 mVでそれを保持することによってパッチを安定させます。
  16. すぐに卵母細胞にさらにピペットを押し、次に静かに引き出してインサイドアウトパッチ、消費税のパッチを入手してください。
  17. インサイドアウトのパッチは現在、クランピングのための準備ができています。灌流先端の開口部から離れて約100ミクロンにインサイドアウトパッチをホールディングピペットを移動します。
  18. 廃棄物の収集のための電子バルブを閉じて、希望する灌流液用タンクのバルブを開き、
  19. パッチ間の電流の録音を開始します。必要に応じて電圧と灌流液を変更します。
  20. 録音が終了したら、目詰まりを避けるために、脱イオン水を介してプッシュすることで灌流チューブ、鉛筆、チップを清掃してください。

4。代表的な結果

パッチクランプのための卵母細胞の準備中に、剥離液の5〜10分の治療では、卵黄膜を除去可能にする形質膜、から卵黄膜を切り離すでしょう。

パッチピペットの理想的な直列抵抗は、ピペット溶液で満たされたと浴溶液に浸漬MΩ1から1.5の間です。

以下は、卵母細胞膜パッチ上の野生型のBKチャネルの代表的な録音です。 50mVの増分で50 mVから200 mVまでの電圧増加の第二段階 - 左上部に、方形波は、パッチに印加される電圧を示している。下記の灌流液が公称値のCa 2 +（フリーの[Ca 2 +]が約0.5 nM）を持って対応する現在のトレースです。の電流振幅のしわは、BKチャネルの開確率は電圧と共に増加することを示しています。右側に、同じパッチは、1.0μMのCa 2で灌流される+と同じ電圧のプロトコルを使用して適用される場合。電流振幅は、[Ca 2 +]の持つオープンな確率が増加することを示す、同じ電圧でより多くを向上させます。
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ディスカッション

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卵母細胞発現系は、内在性のチャンネルの相対的に低い背景に起因する電位依存性イオンチャネルの電気生理学的特性評価に最適です。さらに、それは一過性発現系なので、それはこれらのチャネルの突然変異誘発試験を行うの効率的な方法を提供する。しかし、それは卵母細胞発現系は、哺乳類細胞では異なることに留意すべきである、したがって、異なるサブユニットと翻訳後修飾との関連付けの違いがあるかもしれません。また、脂質​​濃度は、チャネルの機能的特性に影響を及ぼす可能性のある2つのセルの間異なる場合があります。

灌流チューブ、鉛筆、チップは、DI水で詰まりを避けるために、実験後のたびに清掃する必要があります。それは塩化銀でコーティングされていることを確認するためにAg電極線を治療するために新鮮な漂白剤を常に使用する、そうでなければ記録が不正確になります。テストの潜在的なコマンドの潜在的に正確に等しくなるようにデータ取得のための構成設定を調整します。それはきれいなパッチピペットは非常に汚れだけを使用する前にそれらを火 - ポーランドからそれらを保護する蓋を使っておく方がよいだろう。

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開示事項

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利害の衝突は宣言されません。

謝辞

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この作品は、JCJCに健康補助金の国立研究所R01 - HL70393およびR01 - NS060706によってサポートされていましたスペンサーT.オリン基金に関する医工学の教授である。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Nanoject II オートナノリットルインジェクタードラモンドサイエンティフィック3-000-204
P-97 フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラーサッターインストゥルメント株式会社P-97
灌流システムおよび電子制御装置AutoMate Scientific, Inc.ValveLink 16灌流チップの内径:100ミクロン
倒立顕微鏡オリンパス株式会社CKX31
ガラスピペットVWRインターナショナル53432-921
フレーミング/ブラウンマイクロピペット プーラーSutter Instrument Co.P-97
アンプAxon InstrumentsAXOPATCH 200B
Computer InterfaceINSTRUTECH CorporationITC-18
HeadstageAxon InstrumentsCV 203BU

参考文献

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