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皮質の神経形成：研究室の進歩からセルベースの​​治療への移行

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

私はアーノルド・クリックステインです。UCSFの再生医学研究所の所長を務めており、私の専門分野は発生神経生物学です。具体的には、皮質の発生初期段階に非常に強い関心を持っており、神経幹細胞および前駆細胞を対象に、それらがどのようにニューロンを生成し、それらのニューロンがどのように移動して、発達中の脳、特に皮質内で回路を形成し始めるかを研究しています。子宮内エレクトロポレーションの登場は、脳の発達初期段階の研究において、SDO氏とその同僚らによって導入された変革的な技術の一つであると考えられます。この手法により、多種多様な遺伝子について機能獲得および機能喪失実験を行うことが可能になりました。しかも、皮質の発達初期にニューロンを形成している神経幹細胞や前駆細胞に、これらの遺伝子を直接導入することで、比較的シンプルに実施できます。この手法は、胚ステージの動物の大脳室にプラスミド形式のDNAを注入し、その後、短時間の電流を印加することで、室脈を裏打ちする細胞にプラスミドを導入するという単純なものです。これらの細胞は放射状グリア細胞や神経上皮細胞であり、その後、ニューロン、そして最終的にはグリア細胞を産生します。これには、特定の遺伝子の発現をダウンレギュレートまたはノックダウンできる短鎖干渉RNAの使用や、特定の遺伝子産物を直接過剰発現させることが含まれます。これら両方の実験セットによって、発達中の脳における相補的な効果を調べることができます。標的分子には、脳発達の初期段階に関与するもの、あるいはシナプス発達や成熟の段階といった、より後期の段階に関与するほぼあらゆるものが含まれます。この技術の登場は、すでに発達中の脳の研究に大きな影響を与えており、近い将来さらに大きなインパクトをもたらすことが期待されています。脳室を裏打ちし、最終的に脳内のすべてのニューロンとグリア細胞を形成する細胞は、神経上皮細胞として始まります。しかし、ニューロンの発達が始まる時期になると、これらの細胞はラジアルグリア細胞として知られる一種のグリア細胞へと変化するか、あるいは変化し始めます。これらは血管と特殊な接触を行い、若年ニューロンの移動を誘導します。そしてほぼ同時期に、興味深い一連の異なる種類の分裂を開始します。彼らは、自分自身のコピーを増やす、つまり分裂するたびに2つの放射状グリア細胞を産生するという、一種の対称的な前駆細胞分裂を行います。また、これらの細胞は非対称な神経原生分裂も行います。そこでは、細胞周期ごとに自己複製を行い、同時にニューロンとなる娘細胞を1つ生成します。しかし、非常に興味深い3番目の分裂形式を持つことも分かっています。これは、娘細胞が異なるという意味で非対称な分裂です。一方は自己複製した放射状グリア細胞となり、もう一方は別の種類の前駆細胞になります。これは、脳室から移動し、その後、一般的に脳室下帯（subventricular zone）として知られる別の増殖帯で分裂する中間前駆細胞と呼ばれます。子宮内電穿孔法（in utero electroporation）という手法は、これらの細胞がさまざまな種類の分裂を行う段階において、ノックダウンまたは過剰発現用DNAを放射状グリア細胞に導入するための便利な方法です。また、私たちは系統追跡マーカーとして緑色蛍光タンパク質を発現するレトロウイルスも使用しています。同様の週齢の脳室にこのレトロウイルスマーカーを注入することで、個別に標識された細胞が分裂し、娘細胞のクローンを形成していく過程で、それらの細胞の運命を追跡することができます。スライス培養で行うタイムラプスイメージングにより、これらの細胞が皮質へと移行する際の最終的な運命を追跡することが可能です。これまで、脳の発達過程において脳室帯が神経発生の主要な供給源であると考えられてきましたが、胚においては少なくとも、下脳室帯がかなりの量の神経発生の供給源であることがますます認識されるようになりました。我々が発見したのは、下脳室帯において、脳室帯の放射状グリアから生じた中間前駆細胞がそこへ移行し、対称的に分裂することです。この分裂により、さらなる自己複製中間前駆細胞が産生されるか、あるいは対称的な終末分裂によって一対のニューロンが産生され、それが皮質へと移行します。したがって、脳室下帯は、胚性または発達中の脳において、神経発生の非常に重要かつ興味深い領域であることがわかってきました。さらに、これらの中間前駆細胞は、脳室下帯に存在する間、多極細胞となり、その領域内で接線方向に移動する能力を持つと考えられます。そして、このことが、例えば以前にWalshとS Cepcoらが、レトロウイルスを用いて細胞の運命を標識し、発達中の皮質で観察した細胞クローンの分散を説明できる可能性があります。例えば、神経新生またはニューロンの移動に関与している興味深い遺伝子が数多く存在することが分かっています。私たちの研究室では、よく知られたギャップ結合チャネルの形成の基礎となる接続である、ギャップ結合タンパク質について研究してきました。しかし興味深いことに、放射状グリアに沿って移動する細胞は、これらのギャップ結合を通信のためのチャネルとしてではなく、実際には接着分子として利用しており、それによってニューロンや移動細胞が放射状線維に物理的に接着することを可能にしていることを発見しました。そして、それらの研究は、特定のコネクシンの発現をノックダウンするsiRNAを用いて実際に行われました。例えば、コネクシン43は、放射状グリアおよびその娘細胞であるニューロンや中間前駆細胞で非常に高く発現しています。胎児脳由来のいわゆる成人幹細胞の多くは、実際には放射状グリアである可能性が高く、bFGFなどの適切な成長因子で処理することで、培養下で増殖させることができます。しかし、これらの放射状グリアに加えて、中間前駆細胞は幹細胞研究において非常に興味深い標的となる可能性があります。なぜなら、これらは実際には非常に限定された細胞型のニューロンを産生すると考えられているからです。したがって、例えば非常に特定のニューロン細胞を大量に作成するという戦略をとる場合、その特定の細胞型の生成を担う中間前駆細胞を特定し単離することができれば、多様な細胞型を産生する可能性のある放射状グリアを大量に増殖させるよりも、おそらくはるかに優れたアプローチとなるでしょう。実際に、in vitroで行われた研究では、胚性幹細胞株を増殖させ、それらの胚性幹細胞源から個々のニューロンを生成させた際、ほとんどの細胞株がニューロンを実際に生成する前に、必須とも言える上皮様または放射状グリア様の段階を経ているように見受けられます。例えば、Austin Smithがニューロンや神経幹細胞を生成するために用いたプロトコルは、実際には放射状グリア細胞に非常に似ています。それらは向心的な核移動を行い、放射状グリアの転写因子およびマーカーを発現し、放射状グリアと同様の方法でニューロンとアストロサイトを生成します。同様に、Loren Serらはヒト胚性幹細胞を用い、それらが実際にニューロンを生成する前のin vitroにおいて、ロゼットを形成し、神経上皮型の構造へと自己組織化することを見出しました。そこでもやはり、それらのロゼットは放射状グリアに酷似した細胞で構成されています。したがって、これらの放射状グリアがある種の神経幹細胞であるという考えは、このようなin vitroの証拠によって支持されていると考えられます。神経発生が始まる前に、すべての脳室の脳室帯全体、そして実際には脊髄に至るまで、領域的なパターニングがすでに起こっています。特定の領域で発現しているこれらのパターニング遺伝子は、おそらくそこで産生される娘細胞の運命をあらかじめ制限しています。例えば、興奮性錐体細胞を生成したい場合は、背側皮質の放射状グリアがその細胞型を産生しますし、介在ニューロンを産生したい場合は、それらの介在ニューロンを産生する神経節丘の細胞や、あるいはオリゴデンドロサイトなどを産生する細胞を使用することになります。したがって、疾患治療における幹細胞研究の戦略として、特定の種類の介在ニューロンや特定の種類の興奮性投射細胞など、特定のタイプの細胞を大量に作製することが含まれる場合、神経発生におけるこれらの異なる脳領域間の差異を明らかにしつつある発生学的研究が、例えば細胞置換療法のために特定の細胞型のニューロンを増殖させる戦略を設計する上で、最終的に利用可能な手がかりとなるでしょう。また、「再生」や「再生医療」という用語は、本来、臓器を再生させる能力を指唆しています。そして、一般の方々の多くは、幹細胞を損傷した組織の細胞を置換するための手法であると考えていると思われます。しかし実際には、幹細胞研究から誕生する初期の治療法は、おそらくより創造的な、別の形での幹細胞の利用になると考えています。例えば、幹細胞研究とラボを利用して、マウス細胞などの代わりにヒト細胞を用いて疾患をモデル化し、ハイスループット法による薬剤スクリーニングを行うといったことです。また、細胞治療に関しては、すでに始まっていると思いますが、主にデリバリービークル（輸送手段）として利用されると考えています。例えば、特定の幹細胞が損傷部位や疾患部位に遊走する能力を利用して、遺伝子や遺伝子産物、あるいは欠損している酵素などのペイロードを届けるといった方法です。細胞を既存の臓器構造に統合させないというアプリケーションは、より実現しやすい目標であると考えています。そして、初期の細胞治療の例のいくつかは、実際の細胞置換ではなく、そのようなアプローチを採用することになるでしょう。さて、少数のヒト胚性幹細胞以外の使用に対するNIH資金の利用に関する現在の連邦政府の制限は、この分野に実に冷ややかな影響を及ぼしてきました。その影響で、一部の若手研究者がこの分野への参入を断念したり、あるいは胚性幹細胞の研究室における潜在的な有用性を実際に探索することが妨げられたりしてきました。こうした制限を緩和しようとする試みもありました。多くの視聴者がご存知かと思いますが、大統領はある法案に拒否権を行使し、そしておそらく、もう一つの法案に対しても拒否権を行使しようとしています。私たちは、これらの政策が変更され、NIHの資金を利用して、新たに開発された幅広い幹細胞株を研究することが可能になることを願っています。それらの多くは、2001年以前に作成された当初の細胞株よりも優れた利点を持っています。しかし、たとえ資金提供の禁止が解除されたとしても、少なくとも直ちにこの種の研究への資金提供が増えるとは限りません。そして、例えば議会で提案されているこの法案は、資金提供や予算割り当ての法案ではないため、私たちのような研究者が、いわゆる承認済みおよび未承認の細胞株を用いた研究を、同じ研究スペース、同じ研究室で、同じ設備を使用したり一部のリソースを共有したりしながら組み合わせて行うことを容易にするという点において影響を与えることになります。それらはすべて大きな改善となるでしょうが、そのような活動に対する研究費という形での、実際の支援の大幅な流入につながる可能性は低いと考えられます。そのため、依然として民間資金に頼らざるを得ないでしょう。そこには州政府の資金援助も含まれており、ここカリフォルニア州での支援は、幹細胞分野の研究者にとって非常に大きな恩恵となっています。カリフォルニア州に加え、ニューヨーク州、コネチカット州、マサチューセッツ州などの他の州もそれに続き、まもなく独自の州主導の幹細胞研究イニシアチブに資金を提供することになるでしょう。そして、NIHのポリシーが近いうちに変更されるかどうかにかかわらず、それは近い将来において、この分野の研究を推進する重要な原動力になると考えています。

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