雌マウスモデルにおける乳房腫瘍進行の生物発光イメージング

要約

源：
マリーナ・アランテス・ラディッ^キ1、ビクター・カルロス・メロ^1、
ヴィクトリア・パス・マチャド¹、マルシア・クリスティーナ・オリベイラ・ダ・ロシャ¹、ジャクリーン・ヴァス・デ・オリベイラ¹、ルアナ・クリスティーナ・カマルゴ^1,2、ルイス・アレクサンドル・ミュールマン¹、リカルド・ベンテス・アゼベド¹、ソニア・ナイル・バオ¹、ジョアン・パウロ・フィゲイロ・ロンゴ<sup>1

1</sup>ブラジリア大学生物科学研究所 ²ブラジリア大学心理学研究所基礎心理プロセス学科

このビデオでは、ルシフェラーゼ発現乳房腺癌細胞を雌マウスに注射し、生物発光シグナルをモニタリングして原発性および転移性腫瘍の増殖を経時的に評価することにより、in vivoで腫瘍の進行を追跡する手順を示します

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 細胞培養

1. マウス乳房腺癌細胞である4T1細胞株(ATCC-CRL-2539)を、10%ウシ胎児血清(v:v)、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(100 U/mL)を添加したDMEM培地(ダルベッコの修飾イーグル培地)で培養し、37°Cで5%CO₂を含む加湿雰囲気で維持します。
2. 元の細胞株にルシフェラーゼを発現するLuc2遺伝子をトランスフェクトします。この生物発光酵素は構成的に生成されます。

2. 動物モデル - 腫瘍細胞移植

1. 生物発光性ルシフェラーゼ発現4T1細胞(マウスあたり2×10⁵ 細胞)を麻酔下でBalb / c雌マウスの左背側に皮下接種します(ケタミンおよびキシラジンをそれぞれ80 mg / kgおよび10 mg / kg)。
   1. この手順では、特定の麻酔薬(それぞれ80および10 mg / kgのケタミンおよびキシラジン)の腹腔内注射を使用して、実験前にマウスを麻酔します。
   2. 麻酔導入の5分後、マウスを剃り、1mLのインスリン注射器を使用して細胞を皮下注射します。
      注:それぞれ体重約25gの合計5匹の8週間齢マウスを腫瘍誘導およびイメージングに利用した。
2. in vivoでの腫瘍増殖を定量化するには、腫瘍増殖を4週間監視することにより、生物発光イメージングによって腫瘍担保マウスを評価します。
   1. バイオイメージング実験では、イソフルラン(精製された圧縮空気で2.5%希釈)でマウスを麻酔します。腫瘍の進行を評価するには、生物発光シグナルを測定する装置を使用して、週に1回、4週間マウスを画像化します。
      手記： 4T1-luc ルシフェラーゼ生物発光シグナルは、成長を評価し、腫瘍の進行を示すためのパラメーターとして利用されました。
3. イメージングプロセス中に、マウスを機器の指定された領域内の背側横臥位に配置して、生物発光画像をキャプチャします。
4. 麻酔後、マウスにD-ルシフェリン(100 μL;15 mg/mL)を腹腔内注射します。
   手記： D-ルシフェリンは、切断時に光子を生成するルシフェラーゼ酵素の基質であり、4T1-生物発光ルシフェラーゼ細胞はこの酵素を構成的に発現するため、生きた動物で腫瘍を定量化して検出します。
5. シグナルを検出するには、各エンドポイントで各動物について20分間にわたって20枚の生物発光画像をキャプチャします。これらの各画像は、60秒間に放出される生物発光信号を表しています。
6. 毎分放出される信号を表す生物発光速度論曲線を構築します。各動物に最適な結果を得るには、各エンドポイントの最大生物発光放出を記録します。
7. 生物発光画像のキャプチャには、次のパラメータを使用します:発光フィルターオープン、励起なし、ビニング8、f /ストップ2、および視野タイプD。成長曲線を生成するには、週に1回、合計4週間動物を画像化します。
8. 生物発光イメージング - 原発腫瘍と肺転移。
   1. 原発腫瘍と肺転移シグナルを区別するには、装置のソフトウェアを使用して特定の関心領域を定義します。
   2. 細胞が転移した注射部位と胸部の生物発光シグナルを特定します。これらの画像に基づいて、腫瘍の進行と強く相関する生物発光シグナルの進行を計算します。
   3. 数週間にわたって収集された画像を使用して、原発腫瘍や転移性病変を含むさまざまな腫瘍部位の増殖動態プロファイルを作成します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
D-ルシフェリン	パーキン・エルマー	122799	化学試薬
ダルベコスの改良型イーグルのメディウム	ギブコ	A7030	細胞培養培地
ウシ胎児血清	メルク	F2442	細胞培養培地サプリメント
イソフルラン	クリスタリア	NA	麻酔 薬
IVIS ルミナ	XRの	シリーズIII	機器 – 米国
ペニシリン	メルク	P4333	細胞培養用抗生物質
ファロイジン-Alexa Fluor 488	サーモフィッシャー	A12379	化学試薬
リン酸緩衝生理食塩水	メルク	4437568	化学試薬
ストレプトマイシン	メルク	P4333	細胞培養用抗生物質