オプソナイズド赤血球を用いた補体媒介食噬のモデル化

要約

出典: Nagre, N. ほか。 マウスにおける肺胞マクロファージの食いと細菌の除去。 J. Vis. Exp. (2019)。

このビデオは、IgMと補体でオプソン化された羊赤血球を用いて補体受容体介在性食細胞作用の評価を示し、その後マウスマクロファージによる取り込みを行っています。食細胞作用の範囲は、ヘモグロビン触媒によるジアミノフルオレンの酸化によって形成される青色染色生成物を測定することで定量化されます。

プロトコル

1. FcγRおよびCR介在の食細胞作用

1. オプソニゼーションのために、2個×10個^の8枚 の羊赤血球(SRBC)を室温で50μLのウサギ抗SRBC-IgMまたは50μLのウサギ抗SRBC-IgGと30分間インキュベートします。
2. IgMオプソン化されたSRBCを、C5欠損(C5D)ヒト血清50μLを37°Cで30分間インキュベートし、IgM被覆SRBC上の補体断片C3bおよびC3biを固定します。
3. 96ウェルプレートに種子マウスマクロファージ細胞(MH-S細胞)(10,000細胞/ウェル)を置き、一晩培養して~70%のコンフルエンスを得る。MH-S細胞の各ウェルに100 μLの1 x 10⁷/mLオプソニナイズ済みSRBCを加え、37°Cで1時間インキュベークします。未結合SRBCを100μLの塩化アンモニウム塩化カリウム(ACK)溶解バッファーで非常に速く(~1分)洗浄します。
4. 細胞を0.1%のSDSで溶解し、過酸化水素3%と尿素6Mを含む2,7-ジアミノフルオレン(DAF)50μLを加えます。ヘモグロビン触媒によるフルオレンブルー形成の吸収を620nmで測定します。
5. SRBCの数は、既知の数のSRBCで620nm吸光度の標準曲線を用いて決定します。同様に、非オプソニゼーションされたSRBCと共に培養したMH-S細胞をネガティブコントロールとして使用します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2,7-ジアミノフルオレン(DAF)	シグマ・オルドリッチ	D17106	分子生物学のグレード
70%エタノール	デコン・ラボ社	18C27B	分析等級
96ウェルプレート	コーニング	3603	細胞生物学の成績
ACK溶解バッファー	ライフ・テクノロジーズ	A10492	分子生物学のグレード
C5欠損血清	シグマ・オルドリッチ	C1163	生化学試薬
遠心分離機	Labnet International	C0160-R
サイトスピン4 サイト遠心分離機	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	A78300101 第11号
DMEM細胞培養培地	ギブコ	11995-065	細胞生物学の成績
FBS	アトランタ・バイオロジカルズ	S11550	細胞生物学の成績
フローサイトメーター	BDバイオサイエンス	FACSCalibur
フロージョーソフトウェア	フロージョLLC
鉗子	デュモン	0508-SS/45-PS-1	実験動物解剖に適しています
ガラス製ボトムディッシュ	マットテック社	P35G-0.170-14-C	細胞生物学の成績
高圧注射器	ペンセンチュリー	FMJ-250	実験動物用に適しています
均質化装置	オムニ・インターナショナル	TH-01
過酸化水素	シグマ・オルドリッチ	H1009	分析等級
逆形蛍光顕微鏡	オリンポス	IX73
マイクロスプレーアーエアロゾライザー	ペンセンチュリー	IA-1C	実験動物用に適しています
パラホルムアルデヒド	シグマ・オルドリッチ	P6148	試薬グレード
PBS	ギブコ	20012-027	細胞生物学の成績
ウサギ抗SRBC-IgG	MPバイオメディカル	55806	免疫アッセイに適している
反SRBC-IgMのウサギ	シーダーライン・ラボラトリーズ	CL9000-M	免疫アッセイに適している
ハサミ	ミルテックス	5-2	実験動物解剖に適しています
羊の赤血球(SRBCs)	MPバイオメディカル	55876	洗浄・保存されたSRBC