ヒト肺組織における細菌の局在および宿主相互作用のイメージング

要約

出典: Mills, B. ら、 共焦点レーザー内視鏡による異域ヒト肺組織における新規細菌特異的プローブの光学スクリーニング。 J. Vis. Exp. (2017年)

このビデオは、線維共焦点蛍光顕微鏡を用いて、懸濁および肺組織中の蛍光標識された 黄色ブドウ球菌 のリアルタイム画像化を示しています。

プロトコル

1. 共焦点レーザー内視鏡(CLE)によるデータ収集
   1. セットアップ後、ストレージの場所とファイルプレフィックスを選択するウィンドウが開きます。データ保存用のフォルダを選択し、それに応じてプレフィックス名を付けます。
   2. フットペダルは操作者が簡単に取り出せるように配置してください。左ペダル:レーザーオン/オフ;センターペダル:ポーズ;右ペダル:録音/停止。
      注: レーザー操作は画面上の操作からも操作可能です。
   3. 画面上の「スタート」をクリックするか、左足のペダルを押してレーザーをオンにしてください。これにより、100%レーザー出力と12フレーム/秒(デフォルト設定)で画像取得が始まります。
      注: 他の用途では、サンプルの種類に応じて必要に応じて画面上でこれらの設定を変更することができます。
   4. 細菌の懸濁サンプルを画像化してください。
      1. FCFM(ファイバー共焦点蛍光顕微鏡)イメージングファイバーの遠端を挿入し、ゆっくりと懸濁液内を通してサンプルを調査します。
      2. 右足のペダルを押すか画面上の録画コントロールを選択することで、長さ(最大10分)の動画を録画できます。ファイバーがサンプルの周りをゆっくり動く中です。
      3. サンプル間には8% H₂O₂ とレンズクリーニング組織でFCFMの遠位線を清掃します。​
         注: 典型的なビデオ長は10〜30秒で、 体外 画像撮影には十分です。
   5. 肺組織のサンプルを画像化してください。
      1. FCFMイメージングファイバーの遠位端をサンプルに挿入し、ファイバーの端と組織が直接接触するようにします。画像ファイバーの端を優しく動かしてサンプルを調べます。
         注: 線維の端を組織から持ち上げると、組織は焦点面から外れます。しかし、組織に付着していない標識細菌の画像化には利用されます。
      2. 右足のペダルを押すか画面上の録画コントロールを選択することで、長さ(最大10分)の動画を録画できます。ファイバーがサンプルの周りをゆっくり動く中です。
         注: 通常、30秒のビデオ長で組織 外 画像撮影には十分です。
      3. レンズクリーニングティッシュとサンプル間で8%のH₂O₂ を除去し、FCFMイメージングファイバーの遠位端を洗浄します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1-14マイクロフュージ	サイクイップ	90616	小型ベンチトップマイクロ遠心分離機
96ウェルプレート	コーニング	3370	アッセイプレート
カルセインAM	シグマ・オルドリッチ	17783	市販蛍光染料
セルヴィジオ488nmリサーチCLE	マウナケア・テクノロジーズ	LC-0001-488	コンフォーカルレーザー内視鏡装置
クレトップ-S	クレトップ	14110601	繊維クリーナー
エッペンドルフ(1.5 mL)	エッペンドルフ	30120086	1.5 mLマイクロフュージチューブ
Gibcoリン酸塩緩衝塩水	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	10010023	PBS - ウォッシュメディア
ICビューア	マウナケア・テクノロジーズ	LW-0001	研究用CellVizio 488 nmシステムのデータ収集および処理ソフトウェア
非標準研究 AlveoFlex 488 nm	マウナケア・テクノロジーズ	MP-0002-AF3	ファイバー共焦点蛍光顕微鏡ファイバー
クアンティキット 488 nm	マウナケア・テクノロジーズ	LQ-0005	CellVizio 488システムのキャリブレーションキット
S. aureus ATCC 25923	ATCC	25923	本研究で使用された細菌株
セミマイクロ分光光度法キュベット	シグマ・オルドリッチ	C5416-100EA	分光光度法のために
サーモミキサーの快適性	エッペンドルフ	41102422	シェイキング付きのベンチトップヒーター