腸内細菌叢の増強のための カエノラブディティス 寄生虫の選択的清掃

要約

出典:Morgan, E.ら。腸内細菌叢の濃縮を目的とした野生のカエノラブディティス線虫の選択的清掃。J. Vis. Exp.(2021年)

この動画では、野生の Caenorhabditis 寄生虫から関心のある腸内細菌を分離するプロトコルを紹介しています。まずミミズは飢えさせ、洗浄され、表面や腸腔から残留する摂食細菌を除去しつつ、標的微生物を保存します。表面洗浄と複数回の這い進みの工程を経て、ミミズを解剖して目的の細菌を含む腸を抽出し、それらを収集して冷凍保存します。

プロトコル

1. 腸内解剖および微生物種のPCR同定

1. 動物を20°Cで3〜4日間培養し、飢餓させてOP50-1(大腸菌 株 OP50-1)細菌の量を減らす。飢えたミミズのプレートに5mLのM9培地を加えます。

2. 滅菌ガラスピペットとバルブを使い、プレートからM9+ワームをピペットで取り上げ、無菌15mL遠心分離機チューブに移します。

3. 臨床用遠心分離機を使い、チューブ内のワームを室温で1000 x gで30秒間スピンダウンさせます。

4. 無菌の15 mLピペットを使い、チューブ底部の生きたミミズを乱さずに遠心分離管から上清液を除去します。

5. M9 + 0.05% Triton X-100を10mL加え、チューブをヌテーターで20分間培養して外部微生物を除去します。ミミズを洗うために4回繰り返します。

6. 最後の洗浄後、滅菌ピペットの先端を使い、100μL溶液中の底部ペレットを乱さずに上清液を除去します。

7. 滅菌ピペットの先端を使い、M9とミミズを未シードのNGMプレートに移し、ミミズが這い回る間20分間プレートを乾かし、OP50-1をキューティクルと腸から除去します。

8. 乾燥したプレートに250μLのM9を加え、ガラスピペットを使ってM9+ワームを新しい未シードNGMプレートに移します。再度、その皿を乾かしてミミズを20分間這い回らせます。

9. プレートに250μLのM9を加え、100μLのM9+ワームをきれいな時計ガラスに移す。

10. 2本の滅菌26G注射器を使い、片方の針でミミズを押さえつけ、もう一方の針でミミズを切断して線虫の首を切り落とします。首を切断した後、腸(粒状)と性腺(透明性)が自然に体外に出てきます。

11. 露出した腸の一部を、片方の針で腸を押さえ、もう一方の針で切って切り取る。

注: 可能であれば、ノルマルスキー顕微鏡、蛍光生合成法(FISH)、免疫組織化学を用いて、対象の微生物がまだ背出された腸内に存在しているか確認してください。

12. 1つの剥離した腸を0.5mLのPCRチューブに移し、10μLの滅菌水を含みます。異なる動物の腸を含む合計5本以上のPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)チューブを繰り返します。

13. PCRチューブを-80°Cで最低5分間凍結します。冷凍庫からPCRチューブを取り出し、サンプルを解凍してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロース	フィッシャー・サイエンティフィック	BP1356
SDS 10%	インビトロジェン	AM9822
BD プレシジョングライドニードル - 26 G	フィッシャー・サイエンティフィック	305115
KH₂PO₄	フィッシャー・サイエンティフィック	P-286
NaCl	フィッシャー・サイエンティフィック	S-671
NH₄Cl	フィッシャー・サイエンティフィック	A-661
ストレプトマイシン	ミリポール・シグマ	S6501-50G
テトラサイクリン	ミリポール・シグマ	T7660-5G
トライトン X-100	フィッシャー・サイエンティフィック	BP-151
時計のメガネ	VWR	470144-850