マウス腸切片における腸内細菌の蛍光インポジションハイブリダイゼーション

要約

出典: Ng, K. M., Tropini, C. 蛍光の 現場 ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージングによる腸内細菌叢-宿主相互作用の可視化。 J. Vis. Exp. (2021年)。

このビデオでは、蛍光プローブを細菌のrRNA(リボソームリボ核酸)にハイブリダイズさせ、宿主構造を染色して顕微鏡分析を行うことで、マウス腸組織内の腸内細菌叢を染色する蛍光原置ハイブリダイゼーション(FISH)の手順を実演しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手続きは、適切な動物倫理審査委員会によって審査・承認されています

1. FISH(蛍光原位ハイブリダイゼーション)による細菌染色
   1. 液体ブロッカーやPAPペン(撥水性バリアペン)を使って、各組織の領域を丸で囲んで液体の膨張面積を制限してください。インクがセクション自体に触れないように注意してください。組織に接触せずにできるだけ近くに円を作り、ハイブリダイゼーション溶液で覆う表面積を最小限に抑えます。
   2. ハイブリダイゼーション溶液を準備します:予温されたハイブリダイゼーション溶液50μLごとに0.5μgプローブを追加します(例:1 μg/μLプローブの0.5 μL)。ハイブリダイゼーション溶液をスライド上の切片にピペットで塗り込みます(切片や円の大きさによりますが、切片/切片あたり約20μL)。この時点では、培養および保管中に交配溶液とスライドを光から守りましょう。
   3. 柔軟なプラスチックカバースリップを重ねる際、使用する液体の量がセクション全体を覆うようにしてください。蒸発を減らすために、湿ったチャンバーでスライドを培養します。湿潤なチャンバーを作り、ピペットチップボックスに、底に過剰なハイブリダイゼーション溶液やリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で浸したワイプやペーパータオルを置きます。プローブセットによりますが、45〜50°Cで切片を>3時間孵化します。
   4. FISH洗浄バッファーを温めてください:20 mM Tris-HCl、pH 7.4;潜伏期間中は0.9 mのNaClから50°Cまで。コプリンの瓶のスライドを覆うのに十分な洗浄バッファーを用意してください。
   5. プラスチックのカバースリップを外してください。スライドをFISH洗浄バッファーでカップリングし、どちらも50°Cに温めておき、カップリン瓶に入れます。カップリン瓶を再び50°Cのオーブンに戻し、10〜20分間加熱します。厚いサンプルの場合は、カバースリップをコプリンの瓶にバッファーを加えて取り外し、スライスがにじまないようにそっと外します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コープリンジャー	フィッシャー	08-813E
カバーガラス、22 × 22 mm、#1なし	VWR	CA48366-227-1
ダピ	シグマ・オルドリッチ	D9542	5 mg/mLに再懸濁
空のピペットチップボックス			パラフィンを溶かすために
FISHプローブ
FISHハイブリダイゼーションソリューション	--	--	ヌクレアーゼフリー水中の20 mM Tris–HCl pH 7.4、0.9 M NaCl、0.01%(w/v) SDS。5〜50%(v/v)ホルマミドの任意添加
FISH Wash バッファー	--	--	20 mM 三塩酸塩酸 pH 7.4、0.9 M NaCl
蛍光標識されたUlex Europaeus Agglutinin(UEA-1)レクチン	ベクター研究所	FL-1061(蛍光標識)またはRL-1062-2(ロダミン標識)	UEA-1はフコシル化グリカンを標識するため、無菌マウスやフコシルトランスフェラーゼ2(FUT2)欠損宿主のサンプルには適していません。
鉗子
HybriSlipフレキシブルプラスチックカバースリップ、22 x 22 mm × 0.25 mm	シグマ・オルドリッチ	GBL722222	FISHのハイブリッド化段階では、ガラスカバースリップに代用できます
ImmEdge 疎水性バリアPAPペン	ベクター研究所	H-4000
キムワイプズ
多目的標本保存容器、473 mL	フィッシャー	14-955-117A	お好みのガラス容器やポリエチレン容器に置き換えても大丈夫です。メタカーンはポリスチレンや金属とは互換性がありません。
ネイルポリッシュ	電子顕微鏡科学	72180	どんなネイルポリッシュでも使えるはずです
オーブン			必要な温度範囲:45〜60°C
PBS、リン酸塩緩衝生理食塩水(10倍溶液)	フィッシャー	BP3991	プロトコルのために1倍に薄めてください
塩化ナトリウム	フィッシャー	S271
トリズマ塩酸塩溶液、1M Tris-HCl、pH 7.4	シグマ・オルドリッチ	T2663-1L
水、ヌクレアーゼフリー	フィッシャー	BP2484100