レ ギオネラ・ニューモフィラ 外膜小胞の超遠心分離による分離

要約

出典:ユング、A. L.、他レジオネラ肺炎菌外膜小胞:マクロファージにおける炎症促進作用の単離と解析。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオは、逐次遠心分離、無菌ろ過、超遠心分離を用いて レジオネラ 肺炎菌から外膜小胞(OMVs)を分離する方法を示しています。精製されたOMVsは膜タンパク質とリポ多糖を豊富に含み、宿主-病原体相互作用の研究に適しています。

プロトコル

1. レジオネラ・ニューモフィラの栽培

1. L. pneumophila株のCorby(野生型、WT)を緩衝炭酵母抽出物(BCYE)寒天プレートに広げ、37°Cで3日間培養します。前培養皿からL. pneumophilaをOD₆₀₀ 0.3で酵母抽出ブロス(YEB)10mL接種。回転シェーカー(150rpm)で37°Cで6時間培養します。
2. 液体培養液の純度は、懸濁液100μLを血液寒天プレートに広げて確認します。37°Cで一晩抱卵します。
3. 残りの液体培養液を新鮮なYEB培地90mLに加え、回転シェーカー(37°C、150rpm)で培養します。培養時はOD₆₀₀ (約16〜20時間)で3.0〜3.5です。

2. L. 肺炎菌の外膜小胞(OMVs)を準備・定量する

注: 以下の遠心分離工程はすべて無菌条件下で4°Cで実施してください。

1. 液体培養液を4,000 x gで20分間遠心分離して細菌をペレット状にします。上清液を新しい遠心分離機チューブに移し、細菌ペレットを捨てて遠心分離を繰り返します(4,000 x gで20分間)。このステップを一度繰り返します。
2. 残りの上清液を2回(孔径:0.22 μm)無菌でろ過します。細菌のない上清液を超遠心分離機チューブに移し、100,000 x gで3時間超遠心分離機で加熱します。
3. 上清液をデカントして捨てます。OMVペレットを無菌リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)と超遠心分離機(100,000 x g、3時間)に再懸浮させ、汚染タンパク質とLPSを除去します。
4. 上澄液を廃棄し、OMVペレットを500μLの滅菌PBSに再懸濁します。血液寒天プレートおよびBCYE寒天プレートに20μLのストリークを施し、準備済み小胞の細菌汚染を排除します。血液寒天プレートを一晩、BCYE寒天プレートを3日間(いずれも37°Cで)キュベーキュブします。
   注: L . pneumophila 培養液100 mLの濃度は通常1 μg/μLです。準備済みのOMVは-20°Cで保存してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10cmペトリ皿	Sarstedt AG & Co KG(ドイツ、ヌームブレヒト)	82.1473
70 Tiローター	ベックマン・コールター株式会社(カリフォルニア州、アメリカ合衆国)	337922
キュベット	Sarstedt AG & Co KG(ドイツ、ヌームブレヒト)	67.742
ヘラセル240i CO₂インキュベーター	サーモフィッシャー・サイエンティフィック・ドイツ BV & Co KG(ドイツ・ブラウンシュヴァイク)	40830469
ヘレウス・マルチフュージ X3R	サーモフィッシャー・サイエンティフィック・ドイツ BV & Co KG(ドイツ・ブラウンシュヴァイク)	75004515
接種ループ	Sarstedt AG & Co KG(ドイツ、ヌームブレヒト)	86.1567.010
L. 肺炎菌 コービー	---	---
PBS	Biochrom GmbH(ドイツ、ベルリン)	L 1825年
回転シェーカー(MaxQ 6000)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック・ドイツ BV & Co KG(ドイツ・ブラウンシュヴァイク)	SHKE6000
ウルトロスペック10	Biochrom Ltd(ケンブリッジ、イングランド)	80-2116-30
無菌フィルター(孔径:0.22 μm)	コーニング・インコーポレイテッド(ニューヨーク、アメリカ)	431096
活性炭	カール・ロス GmbH & Co KG(カールスルーエ、ドイツ)	X865.2
アガーアガー、神戸I	カール・ロス GmbH & Co KG(カールスルーエ、ドイツ)	5210.2
5%の羊血を持つコロンビア寒天	ベクトン・ディキンソン GmbH(ドイツ、ハイデルベルク)	254005
酵母抽出物	カール・ロス GmbH & Co KG(カールスルーエ、ドイツ)	2363.2