カエノラブディティス・エレガンス関連細菌の単離と培養

要約

出典: Petersen, C. ら、 『モデル線虫 Caenorhabditis elegansの自然微生物叢の分離と特徴付け』。 J. Vis. Exp. (2022年)

この動画は、 Caenorhabditis elegansに関連する細菌種の分離と培養を示しています。C . elegansのビーズベースの溶解と選択的培養により、多様な微生物株を分離し、さらなる解析が可能です。

プロトコル

1. 線虫関連細菌の単離および培養(図1)

1. 細菌を分離するために、96ウェルのプレートに3つの滅菌1mmビーズ、20μLのM9最小中塩(M9)バッファーを各ウェルに準備し、洗浄線虫をピペットで各ウェルに移し、できるだけ少ない液体を移動させます。
   注: あるいは、ミミズの個体群をM9バッファーでプレートから洗浄し、約300μLのミミズ含有M9バッファーを10〜15ビーズ入りの2mLチューブに移すことも可能です。
2. 線虫をビーズ均質剤(例:30Hzで3分間ビーズ叩き)で分解します。板やチューブを短時間遠心分離して液体を底まで送り出します(例:室温で8000 x g で10秒間、RT)。
   注: この方法の使用により、16SリボソームDNA(rDNA)アンプリコンシーケンシングで明らかになったものと同様の細菌分類群が分離され、記載されたビーズビード(ビーズビード)はほとんどの細菌細胞をそのまま残すことを示唆しています。
3. 上清液を採取し、1:10で連続希釈し、最大100μLを9cmの寒天プレートにプレートします。
   1. ほとんどの細菌を培養可能にするために、希釈トリプチカーゼ大豆寒天(TSA、1:10希釈)、マッコンキー寒天、サブローグルコース寒天、ジャガイモデキストロース寒天、酵母ペプトーンデキストロース寒天など、さまざまな栄養成分の代替培地を使用してください。
4. サンプリング場所の平均温度条件(例:温帯地域では15〜20°C)で24〜48時間培養します。
5. 標準的な三条線法と無菌ループを用いて純粋な細菌培養を得る(図1)。
   1. 滅菌ループやつまようじで培植から単一のコロニーを取り、精製に使うのと同じ寒天培地を含む新しい寒天プレートにストライクします。プレートの約3分の1だけを使うようにしてください。
   2. 新しい滅菌ループを使うか、再利用可能なループを滅菌して最初のストリークに通して、同じプレートの1/3に2つ目のストリークを作ります。
   3. この手順を繰り返し、無菌ループを2本目のストリークに引きずります。
   4. 培養に使うのと同じ成長条件下で培養します。この技術は、第3ストリークの領域で単一のコロニーが成長する結果をもたらす必要があります。
      注: 天然分離物はバイオフィルムや凝集体を形成しやすいため、精製工程を何度も繰り返す必要があるかもしれません。
6. 純粋なコロニーを、上記と同じ温度と成長時間で液体培地(寒天培地と同じタイプ)で培養します(ステップ1.4)。

結果

図1:個々の細菌の種同定と分離。 個々の線虫はビーズ均質装置を用いて分解し、DNAはPCRや配列決定 によって 分離されます。あるいは、分解された線虫の材料を連続的に希釈し、培地プレートにプレート状に塗布する方法もあります。プレートは細菌コロニーが現れるまで培養され、新しいプレートにストリークして純粋な培養が得られます。純粋な培養物の単一コロニーは液体細菌培養に用いられ、長期保存用の細菌ストックを-80°Cで準備します。