細胞内細菌群集を含むマウス膀胱上皮細胞の単離

要約

出典: Yang, E. ほか尿路感染症のマウスモデルから生成された単一細胞内細菌群集の単離で、単一細胞解析のための単一細胞解析。 J. Vis. Exp. (2019年)

このビデオは、感染したマウス膀胱から細胞内細菌群集を含む単一上皮細胞を口腔マイクロピペッティングを用いて手動分離する方法を示し、尿路感染症モデルにおける生存可能な宿主関連 大腸菌 集団の下流単一細胞解析を可能にします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手技は、地域の施設動物管理委員会およびJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.細胞内細菌群集(IBC)分離:IBCの口腔ピペット化

注: 本節で述べるすべての手法は、機関のリスク評価を経ています。マウスピペッティングには、移送中の溶液を摂取するリスクが伴います。このリスクは、このプロトコルが使用するナノリットル量によって大きく軽減されており、プロトコルのすべての利用者はここに記載されている予防および実践の注意点に必ず注意することをお勧めします。

1. 細胞をPBS(リン酸緩衝生理食塩水)にスクラップした後、口腔マイクロピペッティング装置(図1C)を設置します。
   1. 引き抜かれたガラス毛細管の太い端(引き抜かれていない端)を吸引管のゴムプラグ(白い端)に挿入します。
   2. 1 mLのピペットチップの細い端を、吸引管のもう一方の開いた(赤い)端に挿入し、しっかりと収まるようにします。
   3. 2 mL吸引ピペットの細い端を、1 mLピペットの先端の開いた広い端に挿入し、再びぴったりとフィットさせます。
      注: このセットアップにより、研究者は吸引ピペットの幅広く開いた端からピペットを口で吸い込み、装置の反対側にある毛細管の狭い端から穏やかな吸引力を生み出すことができます。
   4. 新鮮な脱イオン水を含む100mmのペトリ皿を使って最終口腔マイクロピペッタ装置をテストします。吸引ピペットの開口端にわずかな吸引作用(ストローを通して飲み物をすするのに似た)は毛細血管内の液体濃度を上げますが、脱イオン水が吸引管に溢れることはありません。片手で毛細管を操作し、もう一方の手でペトリ皿の位置を調整します。
      注: 単一のIBCを口でピペットするために必要な吸引の強さは研究者によって異なります。ただし、この技術を試みる研究者は、まず弱い吸引から始め、毛細血管内に液体が流れなければ徐々に吸引を増やすことが推奨されます。飲むためにストローを吸う以上の力は必要ありません。ステップ1.1.4の検査中に毛細血管が液体を捕捉していないように見える場合、毛細血管か吸引管のいずれかが閉塞しており、交換が必要である可能性があります。さらに、新規研究者はまず滅菌水を使って口腔ピペッティング装置の吸引制御を実践することが推奨されます。さらに、口腔ピペッティング装置が取り込む体積の制御は研究者の舌によって行われます。舌は加えられた吸引の強さを細かく調整でき、緊急停止の役割を果たします。
   5. 液体の取り込みに成功したら、吸引ピペットの開口部に優しく吹きかけて毛細管から液体を排出できるかどうかをテストします。ステップ1.5では、液体を排出する過程で気泡が発生しないようにし、IBCの汚染を防ぎます。
      注: 吸引と同様に、研究者がIBCを遠心分離機管内に排出するために加える正圧の強さは研究者によって異なります。このプロトコルに初めて参加する研究者は、実際の感染の数日前にステップ1.1を実践することが推奨されます。口腔マイクロピペッティングの練習の一つの提案は、口腔マイクロピペット装置を使って少量の滅菌水と数滴の食用色素を混ぜて移動させる練習をすることです(視認性を高めるため)。
2. スクレイプした細胞懸濁液を解剖顕微鏡下に置き、IBCを大きな蛍光集合体として識別します(図1A, B)。理想的な倍率範囲は20〜40倍です。毛細管の細い端を新しいPBSチューブに1秒浸し、毛細管作用による不要な体積の取り込みを減らします。
3. 顕微鏡で観察し、目的のIBCを特定し、毛細管の開口端をゆっくりとIBCに近づけます。ガラス毛細管の細い端を使って、各IBCの近くの余分な細胞を掃き出し、2つ以上の細胞の吸引を防ぎ、またはより大きな細胞の集合体を分解します。
4. 顕微鏡で観察しながら、口腔マイクロピペッティング装置の遠端(吸引ピペット)に非常に微細な吸引力を加え、IBCをガラス毛細血管内に導きます。
5. IBCを拾い上げた後、毛細管を空の1.5 mL遠心分離機管に移し、わずかな正圧をかけて液滴とIBCを遠心分離機管内に排出します(図1D参照)。
6. 次の膀胱に進む前に、必要なIBCを1.3-1.6のステップで繰り返します。唾液の蓄積を防ぐために、吸引ピペットや毛細血管を頻繁に交換してください。
   注意: 感染性(または臨床型)細菌を扱う際は、毛細血管内の溶液濃度を常に監視してください。ピペットでピペットする液体の量が毛細管の端から吸引管に溢れ出ないように注意してください。もしそうなったら、すぐに別の吸引管に切り替え、以前のセットアップは捨ててください。
7. 採取したすべての膀胱に対してステップ1.2-1.6を繰り返し、または実験群のために十分な数の生物学的サンプルが採取されるまで続けます。
8. (任意)すべての実験群(またはマウス)が安楽死され、各グループから十分な生物学的サンプルが採取されるまで、ステップ1.6と1.7を繰り返します。

結果

図1:膀胱細胞からのIBC採取。 (A) 細胞スクレーピング前に冷たいPBS溶液中の感染し反逆の膀胱。(B)顕微鏡で見た擦り取った膀胱細胞の画像。IBCは両方の画像で大きな緑色蛍光集合体として識別できます(赤い矢印参照)。(C) 完成した口腔マイクロピペッティング装置の画像。吸引ピペット、ピペット先端、吸引管、引き抜かれた毛細管は、右側に示された番号付きの矢印で識...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 mL ツベルクリン注射器	BDバイオサイエンス	302100
吸引ピペット	BDバイオサイエンス	357558
吸引管	シグマ・オルドリッチ	A5177
顕微鏡用デジタルカメラ	オリンポス	DP71	IBCの画像撮影および収穫のために。GFPチャネルを持つ他の蛍光顕微鏡でも十分です
ガラス毛細管	キマックス	6148K07
アイリス・シザーズ STR SS 110MM	ブラウン	BC110R
顕微鏡用の光源ユニット	オリンポス	LG-PS2	IBCの画像撮影および収穫のために。GFPチャネルを持つ他の蛍光顕微鏡でも十分です
マクロ蛍光顕微鏡	オリンポス	MVX10	IBCの画像撮影および収穫のために。GFPチャネルを持つ他の蛍光顕微鏡でも十分です
マイクロピペット+マイクロピペットチップ			静的細菌培養およびOD測定のために
PBS(リン酸塩水付き生理食塩水)1回			静的細菌培養およびOD測定のために
ポリエチレンチューブ	BDイントラメディック	427401
ステリリン 90mm標準ペトリ皿	熱力学	101VR20	どんな無菌ペトリ皿でも
スティーブンス、血管・腱はさみ、曲線、繊細、110mm	ブラウン	OK366R	膀胱採取に推奨
外科用シザーズ STR S/B 105MM	ブラウン	BC320R
卓上遠心分離機	エッペンドルフ	5810R	15mlの円錐形遠心分離機を冷蔵保存するもの