細菌感染マウス脳における標的遺伝子発現の検出

要約

出典: Zhang, S. ほかマウス感染モデルにおける髄膜炎における 連鎖球菌 スイスバイオフィルムの役割を調査するための頭蓋内くも膜下感染経路。 J. Vis. Exp. (2018年)。

この動画は、細菌感染したマウスの脳における標的遺伝子発現の検出を示しています。RNAは抽出され、DNA分解酵素で処理され、逆転写されてcDNAに変換されます。cDNAは遺伝子特異的プライマーを用いた熱サイクリングによって増幅され、DNA結合染料が増幅されたDNAに結合して蛍光を放出します。蛍光信号は標的遺伝子の存在を確認するために解析されます。

プロトコル

1. 細菌の調製

注:脳髄膜炎の病気の豚から分離された血清型2の毒性株P1/7は、脳膜炎の豚から分離されました。株P1/7はトッド・ヒューイットブロス(THB、1リットルあたりの式:Heart Infusion 3.1 g、ネオペプトン 20.0 g、デキストロース 2.0 g、塩化ナトリウム 2.0 g、リン酸二ナトリウム 0.4 g、炭酸ナトリウム 2.5 g)で培養し、トッド・ヒューイット寒天(THA、THAリットルあたりの式:Heart Infusion 3.1 g、ネオペプトン 20.0 g、デキストロース 2.0 g、塩化ナトリウム、 2.0 g;リン酸二ナトリウム 0.4 g;炭酸ナトリウム2.5g;寒天、15.0g)37°C、5%_CO2。

1. 株P1/7プランクトニック細胞のコレクション
   1. 中間ログ培養(OD₆₀₀=0.6)からプランクトニクス細胞5mLを採取し、8000 × gで遠心分離機で3分間、リン酸塩緩衝生食塩水(PBS)で3回洗浄します。
   2. 細胞をTHBに含めた25%グリセロール5mLで再懸浮させ、5本のチューブに分割して-80°Cで保存します。
2. 株P1/7バイオフィルム状態細胞の収集
   1. 20mLの一晩培養液を取り、180mLの新鮮THBに加えます。希釈した培養液を10枚の円形培養皿に均等に分け、37°Cのインキュベーターで5%_CO2 を24時間入れます。
   2. 培養後、プレートに付着していない細菌を優しく振って再浮遊させ、その後吸引して上澄液を廃棄します。
      注意:プレートを優しく振って、沈殿物を再浮遊させないようにしてください。
   3. PBSを5mL追加してバイオフィルム状態細胞を採取し、沈殿物を完全に再懸濁させてからサンプルを新しいチューブに移します。
   4. 最後のステップからバイオフィルム状態細胞を超音波処理し、次のパラメータで処理します:60W、4サイクル、5秒オン、10秒オフ。
   5. 8000 × gで3分間遠心分離し、上清液を-80°Cで保存します。
      注意:上清液にはバイオフィルム成分が含まれている場合があり、動物実験(ステップ2)で説明されたように、感染前にバイオフィルム細菌を再懸濁させるために使用できます。
   6. THBに25%グリセロール10mLを再懸浮させ、バイオフィルム状態細胞を-80°Cで保存します。

2. 動物実験

1. この研究ではSPFの6週間齢のメスのBALB/cマウスを使用します。すべてのマウスは頭蓋下くも膜下経路を通じて感染し、その注射部位はブレグマから3.5mmの前縁部に位置します。
   1. 組織病理学的解析のために、プランクトニック細胞またはバイオフィルム状態細胞を用いて2群のマウス(1群あたり5匹)を3 ×10⁷ コロニー形成単位(CFU)の用量で感染させ、さらに5匹のマウスにPBSを対照として注射しました。
   2. 脳内のTLR2およびサイトカインのmRNA発現を検出するために、プランクトン細胞またはバイオフィルム状態細胞を用いて3 × 10⁷ CFUの用量でさらに2群のマウス(1群6匹)に感染させます。
   3. THAに連続希釈をプレートして生存可能な細菌の数を測定します。
   4. 感染後12時間ですべてのマウスを安楽死させてさらなる研究を行ってください。​
      注意:ストック培地中のグリセロールは感染前に除去する必要があります。-80°Cから回収されたプランクトン細胞とバイオフィルム状態細胞の両方をPBSで3回洗浄します。その後、プランクトニス細胞をPBSで再懸濁し、感染に適した用量に希釈します。バイオフィルム状態細胞は、保存された上清液(ステップ1.2.5以降)とともに再懸浮し、感染に適した用量に希釈されます。感染量は50μLを超えてはいけません。
2. 脳組織におけるTLR2およびサイトカインのmRNA発現の検出
   1. RNA抽出キットを使って脳組織から全RNAを抽出します。
      1. 各マウスごとに、脳全体の組織を使ってRNAを抽出します。脳組織全体を5本の管に分けます。最大100mgの脳組織を取り、キットで提供された溶解マトリックスを含む各チューブに1mLの溶解液を加えます。
      2. チューブをホモジナイザーで6.0の設定で40秒処理し、その後12000 × g、4°Cで5分間遠心分離します。
      3. 遠心分離後、上部相を新しいマイクロ遠心分離機チューブに移します。
      4. 移管サンプルを室温で5分間培養します。クロロホルム300μLを加え、10秒間ボルテックスし、室温で5分間培養します。
      5. チューブを12000 × g、4°Cで5分間遠心分離します。上位相を新しい管に移してください。
      6. チューブに500μLの冷たい絶対エタノールを加えてから5回反转し、その後-20°Cで少なくとも1時間保存します。
      7. チューブを12000 × g、4°Cで15分間遠心分離し、上清液を取り除きます。ペレットをRNaseフリー水(_H2O)で500μLの冷たい75%エタノールで洗浄します。
      8. エタノールを除去し、ペレットを室温で5分間自然乾燥させ、RNAをRNase_フリーH2Oの100μLに再懸濁させます。
      9. RNAを室温で5分間培養し、RNAバイオアナライザーを使ってRNA濃度を測定します。
   2. 逆転写(RT)試薬キットを備えたサーモサイクラーを用いて、ゲノムDNA(gDNA)の除去を含む補完的なDNA(cDNA)合成を行います。
      1. 5x gDNA除去バッファー2 μL、gDNA除去酵素1 μL、RNaseフリーH_2Oを10 μLまで充填したチューブに1 μgのRNAを加えます。42°Cで2分間インキュベークします。
      2. 最後のステップでマスターミックス10 μL(RT酵素ミックスI1 μL、RTプライマーミックス 1 μL、5x バッファー2 4 μL、RNaseフリーH₂O4 μL)を反応溶液に加え、優しく混めます。直ちにRT反応を進めます:37°Cで15分、その後85°Cで5秒。
      3. SYBR RT-qPCRキットを用いてリアルタイムPCRマシンを用いて定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)解析を行います。2x酵素10 μL、順方向プライマー0.8 μL、逆プライマー0.8 μL、50x ROXリファレンス染料II 0.4 μL、cDNAテンプレート2 μL、RNaseフリーH_2Oを加え、合計20 μLにします。
      4. 各サンプルを以下の熱パラメータで三重に走査します:94°Cで30秒、95°Cで5秒ずつ40サイクル、60°Cで34秒、最終段階は95°Cで15秒、60°Cで1分、95°Cで15秒です。RT-qPCRのプライマーは 表1に記載されています。ハウスキーピング遺伝子 B2m と 18s rRNA が内部対照として使用されました。
   3. ^2-ΔΔCt法に基づいて相対折り変化を計算します。

表1:RT-qPCRのプライマー。

プライマーネーム	シーケンス(5フィート-3フィート)	遺伝子記号
IL-6前方	CTTCCATCCAGTTGCCTTCT	IL6
IL-6の逆方向	CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG	IL6
TLR2フォワード	CACTATCCGGAGGTTGCATATC	TLR2
TLR2の裏面	ガガアガッタッタクトタク	TLR2
CCL2フォワード	CTCACCTGTGTGTGTACTCATTC	Ccl2
CCL2リバース	アクタカッカッタッガカク	Ccl2
TNF-α フォワード	TTGTCTACTCCCAGGTTCTCTCT	TNF
TNF-α逆	GAGGTTGACTTTCTCTCTGTggtatg	TNF
β2m 前方	GGTCTTTCTGGTGTGTGTCT	B2m
β2m 逆	TATGTTCGGTTCCATTCTC	B2m
18秒前方	GTAACCCGTGTTGAACCCCATT	18s rRNA
18の逆行	CCATCCAATCGGTAGTAGCG	18s rRNA

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トッド・ヒューイット・ブロス(THB)	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー	DF0492078	粉末30gを1リットルの浄化水に溶かします。121°で15分間オートクレーブ処理。
寒天	DSBIO	16C0050	粉末15gをTHB1リットルに溶かします。121°で15分間オートクレーブ処理。
ミリQ基準水浄化システム	メルク KGaA	Z00QSVCUS	DNASE/RNASEなし
NaCl	天津化学試薬有限公司	10019318
Na₂HPO₄	西龍科学株式会社	9009012-01-09
KCl	西龍科学株式会社	9009017-01-09
KH₂PO₄	西龍科学株式会社	9009019-01-09
コー	西龍科学株式会社	9009014-01-09
グリセロール	シオンファーム化学試薬株式会社	10010618	同じ量の浄化水で希釈し、121°で15分間オークレーブします
4% パラホルムアルデヒド	シオンファーム化学試薬株式会社	80096675
25% グルターアルデヒド	シオンファーム化学試薬株式会社	30092436	固定のために精製水で希釈した10倍。
エタノール	シオンファーム化学試薬株式会社	10009218
クロロホルム	シオンファーム化学試薬株式会社	10006818
点光度計	デノヴィックス社	DS-11+
超音波細胞クラッシャー	寧博科学バイオテクノロジー有限公司	JY96-IIN
遠心分離機	日立コキ株式会社	CT15RE
冷蔵庫	オークマ株式会社	DW-86L500
FastRNA Pro グリーンキット	MPバイオメディカル	#6045-050
FastPrep-24 計測器	MPバイオメディカル	116005500
PCR用機器	センソクエスト有限会社	1124310110
QuantStudio 6 Flex	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	4485689
SYBR プリミックス Ex Taq II	宝バイオメディカルテクノロジー(北京)株式会社	RR820A
PrimeScript RT試薬キット(gDNA消しゴム付き)	宝バイオメディカルテクノロジー(北京)株式会社	RR047A