マウスモデルにおける肺感染症に対する 結核菌 のエアロゾル投与

要約

出典:Mueller, A., 他結核菌とベルゲイ菌の自然伝播による結核-マラリア共感染を研究する実験モデル。J. Vis. Exp.(2014年)

このビデオは、ネブライザーを用いたチャンバーシステムを用いてマイ コバクテリウム・結核(Mtb) をマウスにエアロゾルで送達し肺感染症を誘発し、空気感染の結合や宿主-病原体相互作用を生体内で研究するための制御された再現性モデルを提供します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手技は、地域の施設動物管理委員会およびJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. グラスコールエアロゾルチャンバーを用いた MTB によるマウスのエアロゾル感染

実験動物の Mtb (結核菌)によるエアロゾル感染を標準化する最良の方法は、既知のCFU(コロニー形成単位)タイターを持つ凍結株から採集されたマイコバクテリアを使用することです。ストック培養を準備するには、ミドルブル ック7H9 ブロスで培養し、OADC(オレイン酸、アルブミン、デキストロース、カタラーゼ)濃縮培地と0.05%のTween 80(マイコバクテリアの炭素源)を同時に用い、細菌凝集防止の対策を講じます。培養は収穫時の光学密度(OD)≤1であるべきです。離度が高いと細菌の凝集が増え、生存率は低下します。1mlのアリコートを-80°Cで保存します。7H11の寒天プレートに3つの独立したバイアルを10倍に希釈し、0.5%グリセロール、1g/Lアスパラギン、OADCを補足して、37°Cで4週間の培養後にコロニーを列挙して、凍結ストック中の生存可能なCFUの数を決定します。以下に説明するエアロゾル感染を行います。

1. Thaw Mtb は既知のCFU抗体価を備蓄し、1mlの注射器に27Gの針を装着して、懸濁液を慎重に5回混ぜて細菌の塊を分散させます。エアロゾルの発生は避けてください。
2. 希望する感染量に応じて、無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む50mlのチューブに必要な量のマイコバクテリアストックを移します。最終巻は6mlです。

注:この懸濁液中の微生物数を変えることで、エアロゾル液滴を持つ細菌の割合が変化します。通常、1つの肺あたり100個の生存可能な細菌の取り込みを目指しています(低用量感染)。私たちの経験では、合計6mlの体積のうち、約1〜2〜2〜10×⁶ Mtb/mlが必要で、そのうち5.5mlがネブライズされています。感染に最適な条件を見つけるために、異なる濃度の細菌を用いた一連の実験的なエアロゾルチャレンジを行うことが推奨されます。最大5,000個のマイコバクテリアを含む高用量感染は感染過程を早めるために可能ですが、エアロゾルでマウスに感染させるにはわずか5個程度で成功します。感染率は通常100%です。

3. 接種量を測定するために、メッキのために必要な最終体積を超える十分な量を除去します。通常、500μLを除去して技術的な三重板を板付けします。
4. 動物を区画付きのメッシュバスケット(バスケットごとに1匹のマウス)に入れ、円形エアロゾルチャンバーの中に置き、蓋を閉めます。

注: 他のモデルは、5つの個別の区画からなるパイ型のバスケットを装備しており、それぞれ20匹のネズミを収容可能です。

5. ベンチュリ・ネブライザーユニットを3つのステンレス製ソケットジョイントに接続します。
6. 10mlの注射器に18Gの鈍針を装着し、50mlチューブからマイコバクテリア懸濁液を除去し、密閉された輸送箱内のエアロゾルチャンバーへ運びます。
7. ネブライザーユニットのスクリューキャップを外し、マイコバクテリアの懸濁液を慎重にネブライザーに注入してください。エアロゾルの発生を避けましょう。注射器を2%のブラトン入りのシャープス容器に捨てます。ネジキャップでネブライザーを密閉してください。
8. メインの電源スイッチとUVランプを点けてください。コントロールキーパッドの表示には「グラス・コル・アパラタス社」と表示されています。
9. プログラムのスイッチを入れて。ディスプレイには「ネブライザーの準備はできていますか?」「バスケットは装填されていますか?」と表示されます。準備ができたらエンターを押してください。エンターを押してください。
10. 表示には「予熱時間900入り」と表示されています。つまり、排気空気を除染する焼却炉の予熱時間は900秒となります。エンターキーを押してください。
11. 表示には「ネブライジング時間1,800の入力」が表示されます。つまり、ネブライジング時間はデフォルトで1,800秒に設定されています。ネブライジング時間を延長するには、「2,400」を入力してエンターキーを押してください。

注: ネブライジングサイクル中、加圧された空気が懸濁液を原子化し、マイコバクテリアを含む小さなエアロゾル液滴を生成します。主空気の流れとともに、これらの水滴(約2〜5μmの大きさ)がエアロゾルチャンバーに運ばれます。

 

12. 表示には「Enter C.D. Time 1,800」と表示されます。つまり、崩壊サイクルは1,800秒かかります。「2,400」に設定してEnterを押します。

注: このサイクル中、ネブライジングサイクル中にエアロゾルチャンバー内に蓄積された雲が崩壊することがあります。小さな水滴は実験動物によって吸入されます。

13. 表示には「12月の時間900に入る」と表示されます。つまり、UVライトの除染サイクルは900秒かかります。エンターキーを押してください。機械は予熱、ネブライズ、雲の崩壊、UV除染を繰り返します。
    注意: 真空流量計は60立方フィート/時を示し(予熱サイクル開始時を確認、必要に応じて真空制御バルブを調整)、圧縮空気流量計は10立方フィート/時(ネブライジングサイクル開始時を確認し、空気制御バルブを適切に調整)を示すべきです。
14. サイクルが完了すると、キーパッドに「プロセス完了 – 試料の除去」と表示されます。プログラム、UV、メイン電源スイッチをオフにしてください。
15. マイコバクテリア懸濁液が完全にネブレーションされているか確認し、そうでない場合は18Gの鈍針を装着した適切な注射器で慎重に懸濁液を除去して残りの容量を記録してください。残りの容量は1mlを超えてはいけません。
16. ネブライザーを関節から外し、2%のブラトン入りの鍋に最低2時間浸します。通常はO/Nで消毒を行います。その後、ネブライザーを新しいフライパンに移し、水でよくすすぎます。ネブライザーは自然乾燥させておきます。
17. エアロゾルチャンバーを開けて、動物をケージに戻します。バスケットはオートクレーブバッグとオートクレーブで袋に入れてください。エアロゾルチャンバー内部の表面を2%のブラトンで拭き取ります。

注意:安全上の理由から、この処置中は電動空気清浄呼吸器を着用してください。

18. 残りの500μlのマイコバクテリア懸濁液(ステップ1.3参照)を用いて、技術的三重(3×100μl)を10倍に希釈して7H11寒天プレートにプレートします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
バラトン	シュルケ		有効成分:アルデヒド(ホルムアルデヒド、グルターアルデヒド、オキサルデヒド、エチルヘキサナル)
ミドルブルック 7H9	シグマ	M0178	MTBのブロス培養については
ミドルブルック 7H11	BDバイオサイエンス	283810	MTB文化用の寒天培地
ミドルブルックOADC濃縮培地	BDバイオサイエンス	212240	MTB文化には7H9と7H11を加えます
吸入曝露システム	グラス・コル
ネブライザー・ベンチュリ	グラス・コル