マウスの細菌感染の生物発光イメージング

要約

出典:de Vries, C. R.ら、慢性緑膿菌創傷感染の遅延接種モデル。J. Vis. Exp.(2020年)。

このビデオでは、生きたマウスモデルにおける細菌感染の進行を監視するための生物発光イメージング技術を実演しています。 luxABCDE レポーターシステムで設計された病原性細菌は感染部位で光を放出し、代謝活性のある細菌の可視化を可能にします。マウスを時間をかけて画像化することで、非侵襲的に感染動態を追跡し、生物発光信号の強度を定量化できます。

プロトコル

1. 細菌の調製と増殖

1. 研究者の機関バイオセーフティ委員会および動物利用委員会のガイドラインに従い、 P. aeruginosa および動物に関するすべての研究はBSL-2の予防措置で実施してください。ここで説明したP . aeruginosaに関するすべての手順、マウスの予防接種を含め、バイオセーフティキャビネット内で実施してください。
2. 発光性のPAO1:lux株である P. aeruginosa は、当研究所からご要望に応じて入手可能です。凍結グリセロールストックとして保存されたPAO1のストリークが溶原ブロス(LB)寒天に含まれています。発光するPAO1:lux株については、LB寒天に選択的抗生物質(100 μg/mLカルベニシリンおよび12.5 μg/mLカナマイシン)が含まれている必要があります。細菌培養盤で37°Cで一晩育てます。
3. 隔離されたコロニーを選び、3mlのLB培地で37°Cで一晩育て、pH7.4。発光株の場合、ブロスには100μg/mLのカルベニシリンが含まれているべきです。揺れる好気性のある環境で成長しましょう。

2. 手技準備

1. 手術を行う全スタッフには清潔なガウン/白衣、フェイスマスク、ヘアネット、手袋を着用してください。
2. ハサミや鉗子を含むすべての外科用器具でオートクレーブ消毒してください。動物同士で工具を滅菌するには無菌技術を用いてください。
3. 手術台をエタノールで清掃し、清潔な手術フィールドを準備します。

3. 脱毛

1. 8〜12週齢のC57BL/6Jマウスに1%〜3%イソフルランを用いて麻酔します。研究者はイソフルラン使用時に所属機関の獣医スタッフの麻酔ガイドラインに従うべきです。
   1. 麻酔を開始時は1%〜3%のイソフルランを投与し、酸素流量を1.5 L/minに調整します。マウスを誘導室に入れます。
   2. 麻酔の深さを確認するために、ネズミの足の指をつまんでみます。マウスが刺激に反応しなくなったら、誘導室から取り出し、鼻をイソフルラン鼻錐に乗せて手術台に置きます。
   3. 両目に眼用潤滑剤を塗ってください。
2. マウスの体重を測って、手術前の基準体重を得てください。
3. マウスをうつ伏せの姿勢に置きます。マウスに事前に温めた無菌0.9%塩化ナトリウムを両側に250μL、合計500μLを皮下注射します。
4. 電動シェーバーでマウスの背中部分を剃ります。毛の汚染を防ぐために、剃毛は手術ステーションとは別の場所で行うべきです。
5. 薄く脱毛クリームを塗ります。ローションを20〜60秒ほど置いてください。髪と余分なローションは、ぬるま湯に湿らせたガーゼで除去します。脱毛後は切除傷術に進みます。

4. 全層切除創傷手術

1. マウスの背側中央部に25Gの針を使い、持続放出型ブプレノルフィン0.6–1 mg/kgを皮下注射します。徐放性ブプレノルフィンは48〜72時間で痛みの緩和効果があります。
2. 手術部位を消毒しろ。背面を無菌のベタジン綿棒で拭き取ってください。余分なベタジンは滅菌アルコール綿棒で拭き取ってください。これはベタジンとアルコールを交互に3回行い、中心から円を描くように端まで移動して綿棒を採取します。その場所を自然乾燥させます。
3. 無菌ガーゼやラップで手術部位を囲むドレープを作りましょう。
4. 皮膚を後方的に引き締めて伸ばす。左背側表皮に最初の切開を入れるには、直径6mmの無菌皮膚生検パンチを用います。右背側表皮でも同じことを繰り返します。
5. 鉗子を使って、左側の輪郭が描かれた傷口の中央から皮膚をテント状にします。はさみで表皮と皮層を切除します。右側の傷口の輪郭を繰り返して、対称的な切除創を作ります。
6. 傷口は50μLの無菌生理食塩水で洗浄します。手術部位と周囲の皮膚を自然乾燥させます。その後、傷口と背面を透明なフィルムドレッシングで覆います。
7. ネズミをきれいなケージに戻してください。ケージごとに動物を1匹飼います。
8. ケージを温熱パッドの上に置き、ネズミが目覚めるまで監視します。
9. 上記の手術を複数の動物に行う際は、熱いビーズ滅菌器を使って動物間の手術器具をすべて洗浄してください。
10. マウスが手術から回復し、傷口の上に仮の創傷マトリックスを形成するまでに24時間の期間を置き、その後細菌による接種に進みます。

5. P. aeruginosaの接種

1. 100 μg/mLカルベニシリンを含む75 mLのLB培地で、PAO1:luxを一晩でOD600 = 0.05に希釈し、培養が初期指数相(OD₆₀₀ ≈ 0.3)になるまで培養します。これには約2〜3時間かかるはずです。
2. PAO1を希釈してPBSの濃度を(7.5 ± 2.5)×10² CFU/mLにします。実験後に十分な量を確保し、プレート付けのために余分な接種量を用意してください。施設間(実験室からビバリウムまで)を移動する場合は、「Biohazard」と明確に記された漏れ防止箱に二重封じ込めを施してください。
3. P . aeruginosa およびマウスの作業は、動物バイオセーフティレベル2(ABSL-2)承認された生物安全キャビネット(BSC)内で、承認された個人用保護具を使用して実施してください。体重計のような再利用可能な機器は、汚染を防ぐためにラップで覆うべきです。
4. 上記の3%イソフルランで麻酔を行います。マウスの重さを測って、その重さを記録してください。マウスに事前に温めた無菌0.9%塩化ナトリウムを両側に250μL、合計500μLを皮下注射します。
5. もしネズミの透明なフィルムドレッシングが一晩で剥がれていれば、できたかさぶたを慎重に取り除き、新しいドレッシングを塗り替えてください。
6. 500μLのツベルクリン27G安全キャップシリンジを使い、PAO1:lux懸濁液を透明なフィルムドレッシングを通して各創傷に40μL注入します。非接種/PBS創傷制御には、対側からの交差汚染を防ぐために異なるマウスを使用するべきです。
7. マウスをケージに戻し、温熱パッドの上に置いて目覚めるまで監視します。すべてのマウスは交差汚染を防ぐために個別にケージに入れて飼育してください。
8. ケージの床にフードペレットの間に挟んで高カロリーの栄養補助ペーストを用意してください。
9. 残りの接種点を使ってLB寒天プレートにストリークします。投与された細菌の数を確認するためにコロニー数を数えましょう。

6. 感染した創傷の生体内画像診断

1. マウスの移動および移動には、BSL-2の収容プロトコルに従い、二次容器の使用も含まれます。誘導室や画像診断機器に移送する際、動物の寝具を移動させたり落としたりしないよう注意してください。
2. 誘導チャンバーで1%〜3%のイソフルランを吸入してマウスに麻酔を誘導します。
3. マウスが麻酔されたら、光学イメージングシステムのイメージングチャンバー内でうつ伏せの状態に置き、鼻をイソフルランの鼻錐に置きます。
4. ソフトウェアを開いてください。
5. 取得パラメータは、同時に撮影される動物の数や生物発光の強度によって異なります。設定する基本的なパラメータには、露光時間、ビニング、絞り値、視野角(FOV)が含まれます。デフォルトの開始設定は露出時間30秒、低ビニング(2秒)、絞り/停止1.2、FOV25です。研究者のニーズに応じてこれらの設定を調整してください。
6. イメージングプログラムを使って発光データを解析します。ルミネッセンスは、マウスのカラー写真に擬似カラー画像を重ねて表現します。
   1. 創傷部位に関心領域(ROI)を作成し、検出された平均光束(光子/秒)を測定します。データは放射度(光子/秒/cm²/ステラディアン)でも報告可能ですが、イメージングプラットフォームからカメラまでの距離が画像間で一定であれば、フラックスは十分です。
   2. 画像プラットフォームのランダムな場所でROIを測定して背景を測定します。背景光子数を秒単位で引く。
   3. データをスプレッドシートにエクスポートして、さらに分析してください。
7. 感染の進行を追跡するために、上記の通りの画像検査を毎日行う。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.9%塩化ナトリウム注入	ホスピラ	2484457
18 G x 1本の滅菌針	BD	305195
25 G x 1 1/5 滅菌針	BD	305127
アルコール綿棒検査	BD	326895
オーライメージングソフトウェア	スペクトル機器イメージング	該当なし
ベタジン	パデュー・フレデリック・カンパニー	19-065534
ブプレノルフィンSR LAB	ズーファーム	該当なし
C57BL/6Jオスマウス	ジャクソン研究所	664
使い捨て生検パンチ、6mm	インテグラ	33-36
ファインシザーズ - タングステンカーバイド	ファインサイエンスツール	14568-09
ガラスビード乾燥滅菌器	ハーバード・アパラタトゥス	61-0183
顆粒入り寒天	フィッシャー・バイオリエージェント	BP9744
ヒーティングパッド	ミリアード	804879481218
28Gの針付きインスリン注射器	BD	329461
ラゴXイメージングシステム	スペクトル機器イメージング	該当なし
LBブロス	フィッシャー・バイオリエージェント	BP1426
ルールロク1mLシリンジ	BD	309628
ミニアルコ動物トリマー	ウォール・プロフェッショナル	919152
ベビーオイル入りのNair脱毛ローション	チャーチとドワイト	該当なし	どの薬局でも入手可能です
八角形鉗子	ファインサイエンスツール	11041-08
ペトリ皿	ファルコン	351029
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)1回	コーニング	21-040-CV
プレス&シールラップ	よかった	該当なし
SafetyGlideインスリン注射器(30G針付き)	BD	305934
セーフティグライドインスリンシリンジ、1/2mL、30G x 5/16 TW	BD	305934
スケール	オハウス・スカウト・プロ	SP202
補足栄養補助	ヘンリー・シャイン動物保健	29908
テガダーム、6 cm x 7 cm	3歳	1624W