蚊の中腸から細菌の分離

要約

出典: Liu, X. ら。 抗生物質処理済みの蚊を用いた細菌経口給餌アッセイ。 J. Vis. Exp. (2020年)

この動画では、蚊の中腸を解剖して腸内細菌を分離する方法を実演しています。中腸は消化管から抽出され、均質化されて細菌を放出し、栄養寒天にプレートされて細菌コロニーを培養します。

プロトコル

1. 蚊の中腸を解剖する
   1. 表面滅菌した蚊をガラススライドに移し、無菌のリン酸塩緩衝生食塩水(PBS)バッファー1滴を使います。解剖顕微鏡で解剖してください。
   2. 解剖顕微鏡の低倍率で、蚊の脚、翼、頭部を慎重に取り除き、逃げないようにします。蚊の最後の体を引っ張るのではなく直接切り取り、消化管の破損を防ぎます。
   3. 蚊の胸部と腹部の端を鉗子で挟みます。蚊の消化管を優しく引き抜きます。後天性消化管には通常、作物管、前腸、中腸、後腸管、そしてマルピギ管が含まれます。
   4. 解剖顕微鏡をより高い倍率に調整してください。解剖した消化管からクロップ管、前腸管、後腸管、マルピギ管を除去し、蚊の中腸を入手します。
   5. 作物を取り除く際は注意してください。蚊が砂糖を摂取すると作物は膨らみ、中腸のように膨らんでしまいます。マルピギ管は、長く細い排泄管の群れで、中腸と後腸の境界に位置しています。
2. 腸内細菌を分離する
   1. 解離した中腸を無菌1.5mLチューブに移し、200μLの無菌1xPBSバッファーを装填します。
   2. 中腸を滅菌の台で無菌乳棒でしっかり挽き、腸内細菌がバッファーに完全に放出できるようにします。
   3. ホモジネートを連続的に希釈し、10倍の希釈を3回にします。各希釈物をLB(ルリアブロス)寒天プレートに加え、プレートに広げます。中腸に高濃度の腸内菌叢が含まれている場合は、単一コロニーを特定するためにさらに連続的に希釈することが不可欠です。
   4. プレートを37°Cで1〜2日間孵化し、単一のコロニーが見えるまで待つ。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アデス・エジプト			メスの蚊
遠心分離機チューブ	サンゴン・バイオテック	F601620-0010	1.5mL、天然、グラデーション、滅菌
使い捨て組織すりすり棒	サンゴン・バイオテック	F619072-0001	70 mm 長さ、円錐形、青く、無菌
鉗子	後輪駆動	F11029	解剖
LB寒天粉	サンゴン・バイオテック	A507003	トリプトン10.0g、酵母抽出物5.0g、NaCl10.0g、アガー15.0g。
顕微鏡	ツァイス	Stemi508
10倍PBSバッファ	サンゴン・バイオテック	E607016	この製品は10倍の解決策です。使用前に10回薄めてください。pH値は7.4です。