成虫蚊における明確な腸内細菌集団の確立

要約

出典: Liu, X. ら。 抗生物質処理済みの蚊を用いた細菌経口給餌アッセイ。 J. Vis. Exp. (2020年)

この動画は、抗生物質を含むショ糖溶液を用いて蚊の在来腸内微生物叢が減少する様子を示しています。その後、膜給餌システムを通じて細菌の懸濁液を投与し、蚊の腸内に明確な細菌集団を確立する制御された再定着が行われます。

プロトコル

1. 抗生物質治療と細菌の再導入

1. 抗生物質溶液を準備してください。
   1. 必要なショ糖、ペニシリン、ストレプトマイシンの量を計量し、10%ショ糖溶液を準備します。これにはペニシリン20単位とストレプトマイシン20μgを1mL含みます。
2. 抗生物質溶液を蚊に与えましょう。
   1. 蚊を4°Cで3〜5分間麻酔します。蚊を紙コップに移します。上部をガーゼで覆い、蚊の逃げを防ぐためにガーゼをテープで包みます。
   2. 滅菌コットンボールを抗生物質溶液に浸し、慎重に蚊のカップに置いてください。使用前にコットンボールを絞って、滴るコットンボールに蚊が溺れないようにしてください。
   3. 綿球を10cmのペトリ皿で覆い、湿気の蒸発を防ぎます。綿ボールは3日連続で1日2回交換してください。
3. 細菌懸濁液の調製
4. 分光光度計で細菌溶液を測定してください。1 mLのチューブに1 OD(OD₆₀₀₀)の細菌懸濁液を加えます。5,000 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
5. 上清液を廃棄し、1.5mLのチューブに1mLの無菌1x PBSバッファーを加えて懸濁沈殿を行います。
6. 遠心分離機で5,000 x g、4°Cで5分間加熱;上澄液を捨てる。
7. ステップ2.4.2と2.4.3を繰り返します。
8. 細菌沈殿液に200μLの滅菌1xリン酸塩緩衝塩水(PBS)バッファーを加えます。
9. 10%ショ糖溶液600 μL、食性刺激作用を持つ10 mmアデノシン5′-三リン酸(ATP)200 μL、細菌懸液200 μLを無菌1.5 mLチューブに加えます。渦巻きで混ぜます。
10. 蚊にバクテリアの懸濁液を与えてください。
    1. 蚊を24時間飢えさせ、抗生物質が代謝される前に細菌に餌を与えます。
    2. 膜供給システムを組み立てろ。
    3. 滅菌されたフィーダーユニットはパラフィルムまたは代わりにコラーゲン膜で密封します。
    4. プラスチックリングを装着し、パラフィルムで固定して給餌時の摩擦による破損を防ぎます。
    5. 準備済みの細菌溶液をゆっくりとフィーダーユニットに加えます。
       注: 2井戸フィーダーユニットのうち溶液で満たせるのは1つの井戸のみで、試薬滴下側からのみ給料ユニットを覆います。
    6. フィーダーユニットを37°Cで予熱された給餌システムに接続し、人間の体温を模擬して蚊を引き寄せます。餌を蚊の入った紙コップに置き、90分間餌やります。
    7. 餌を与えた後、蚊を4°Cの温度で3〜5分間麻酔し、冷たいペトリ皿で麻酔したまま保ちます。
    8. さらに研究のために、完全に膨れ上がった蚊を選びましょう。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アデノシン 5′-三リン酸二ナトリウム塩水和物	シグマ	A2383	アデノシン5′-三リン酸二ナトリウム塩水和物が用いられ、アデノシン三リン酸(ATP)標準溶液の製剤に用いられています
ヘモテック膜給餌システム	ヘモテック		給餌システムの構成要素には、Hemotek温度制御装置、フィーダーハウジングアセンブリ、金属フィーダーの組み立てが含まれます。
パラフィルム	サンゴン・バイオテック	F104002	4 インチ x 125フィート
ペトリ皿	サンゴン・バイオテック	F611203
ペニシリンGプロカイン塩水和物	サンゴン・バイオテック	A606248	白い粉。水に溶け、メタノールに溶け、水にわずかに溶けやすい、エタノールに溶けます
ストレプトマイシン硫酸塩	サンゴン・バイオテック	A610494	硫酸ストレプトマイシンはグルコサミン系の抗生物質で、原核生物タンパク質の合成を妨げます。
ショ糖	サンゴン・バイオテック	A502792	水、エタノール、メタノールに溶け、グリセロールやピリジンにわずかに溶けます。
10倍PBSバッファ	サンゴン・バイオテック	E607016	この製品は10倍の解決策です。使用前に10回薄めてください。pH値は7.4です。